Blog

Mar 16, 2023

Messung der Antigenexpression von Krebszelllinien und zirkulierenden Tumorzellen

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 6051 (2023) Diesen Artikel zitieren

476 Zugriffe

Details zu den Metriken

Bei der Bewertung von EpCAM-basierten Anreicherungstechnologien für zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sollten die verwendeten Zelllinien echten CTCs sehr ähnlich sein, was bedeutet, dass die EpCAM-Expression von CTCs bekannt sein muss, aber auch die EpCAM-Expression von Zelllinien an verschiedenen Institutionen und zu verschiedenen Zeiten wichtig. Da die Anzahl der CTCs im Blut gering ist, haben wir die CTCs durch die Abreicherung von Leukozyten aus diagnostischen Leukaphereseprodukten von 13 Prostatakrebspatienten angereichert und die EpCAM-Expression mithilfe quantitativer Durchflusszytometrie gemessen. Die Antigenexpression wurde zwischen mehreren Institutionen verglichen, indem die Kulturen jeder Institution gemessen wurden. Für eine der verwendeten Zelllinien wurde auch die Einfangeffizienz gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass CTCs, die von kastrationsempfindlichen Prostatakrebspatienten stammen, eine unterschiedliche, aber relativ niedrige EpCAM-Expression aufweisen, wobei die mittlere Expression pro Patient zwischen 35 und 89.534 (durchschnittlich 24.993) Molekülen pro Zelle liegt. Es wurde eine große Variation in der Antigenexpression identischer Zelllinien festgestellt, die in verschiedenen Institutionen kultiviert wurden, was bei Verwendung des CellSearch-Systems zu Wiederfindungsraten zwischen 12 und 83 % für dieselbe Zelllinie führte. Wir kommen zu dem Schluss, dass bei Verwendung derselben Zelllinie große Unterschiede in der Einfangeffizienz auftreten können. Um echten CTCs von kastrationsempfindlichen Prostatakrebspatienten möglichst ähnlich zu sein, sollte eine Zelllinie mit einer relativ geringen EpCAM-Expression verwendet und deren Expression regelmäßig überwacht werden.

Zelllinien werden häufig verwendet, um verschiedene Methoden zu vergleichen oder Protokolle für die Anreicherung und Isolierung zirkulierender Tumorzellen (CTCs) zu optimieren. Die verwendeten Zelllinien werden in einigen Artikeln oder Rezensionen angegeben, in denen verschiedene Anreicherungstechnologien verglichen werden1,2,3,4. Dies ermöglicht einen scheinbar faireren Vergleich, da Merkmale wie Größe, Verformbarkeit und Antigenexpression zwischen verschiedenen Zelllinien stark variieren können. Insbesondere die letztgenannte Eigenschaft ist bei der Bewertung antigenbasierter Anreicherungstechnologien von großer Bedeutung.

Bei der Verwendung eines Oberflächenantigens zum selektiven Einfangen seltener Zellen müssen zahlreiche Wechselwirkungen zwischen den beschichteten Oberflächen und den Zellen erzeugt werden, wobei gleichzeitig die Zurückhaltung der eingefangenen Zellen gewährleistet werden muss. Die hierfür am häufigsten verwendete Methode ist die immunmagnetische Erfassung, bei der (superpara-)magnetische Kügelchen mit einem Antikörper beschichtet werden5. Für die CTC-Erfassung ist in den meisten Fällen das epitheliale Zelladhäsionsmolekül (EpCAM) das relevante Antigen, ein Antigen, das bei den meisten Krebsarten epithelialen Ursprungs sowohl im Tumorgewebe als auch in CTCs überexprimiert wird6. Ein Beispiel für die immunmagnetische Anreicherung ist das CellSearch-System, die am häufigsten verwendete Methode zur CTC-Anreicherung7.

Die Effizienz einer solchen Anreicherung hängt weitgehend von der Anzahl der auf der Zelloberfläche vorhandenen Antigene ab. Daher sollten bei der Bewertung dieser Technologien Zelllinien mit vergleichbaren Expressionseigenschaften verwendet werden, um so echte CTCs besser nachzuahmen. Hierbei sollten nicht nur Merkmale berücksichtigt werden, die zur Erfassung verwendet werden, sondern auch diejenigen, die zur Identifizierung von CTCs verwendet werden. Es hat sich beispielsweise gezeigt, dass das Cytokeratin (CK)-Expressionsniveau der häufig verwendeten LNCaP-Zelllinie viel höher ist als das der Patienten-CTCs8, was ihre Identifizierung unrealistisch einfach macht.

Die Verwendung einer Zelllinie mit einer realistischen EpCAM-Expression ist umso relevanter, wenn man die neueren Erkenntnisse über die Existenz einer Subpopulation von EpCAM-niedrigen oder sogar EpCAM-negativen CTCs berücksichtigt9,10,11,12,13. Mehrere Studien haben bereits versucht, die Empfindlichkeit ihrer Antigen-basierten Einfangmethoden zu erhöhen, entweder durch die Verwendung zusätzlicher Antigene14,15 oder durch Erhöhung der erzeugten magnetischen Kraft16,17,18, während viele sich auch auf völlig EpCAM-unabhängige Einfangmethoden konzentriert haben19. Diese Methoden sind alle darauf ausgelegt, auch Zellen mit geringer EpCAM-Expression zu erfassen. Sogar das CellSearch-System verwendet einen speziellen patentierten Ansatz, um ausreichend magnetische Partikel an CTCs mit geringer EpCAM-Expression zu binden20.

Da jede Erhöhung der Empfindlichkeit im Allgemeinen auf Kosten der Spezifität geht, wäre es von Vorteil, die erforderliche Empfindlichkeit eines solchen Systems zu kennen. Hierzu muss das Antigen-Expressionsniveau von CTCs in Patientenproben bekannt sein. Obwohl es mehrere Studien gibt, in denen die Expression von EpCAM auf CTCs untersucht wird21,22,23, haben nach unserem besten Wissen nur Rao et al. haben versucht, die EpCAM-Expression von CTCs24 quantitativ zu messen, und zeigten große Unterschiede zwischen der gemessenen EpCAM-Expression und mehreren häufig verwendeten Zelllinien. In dieser Arbeit legen sie jedoch einen minimalen EpCAM-Expressionsschwellenwert für die Identifizierung von CTCs fest und schließen so alle EpCAM-niedrigen oder negativen CTCs aus. Dies bedeutet, dass eine Quantifizierung der EpCAM-Expression in der gesamten CTC-Population erforderlich ist, um effektiv die repräsentativsten Zelllinien auswählen zu können, was eine realistische Bestimmung der Empfindlichkeit jedes EpCAM-basierten Capture-Assays ermöglicht.

Hierzu muss nicht nur die EpCAM-Expression in CTCs, sondern auch die mehrerer Zelllinien bekannt sein. Da sich Zelleigenschaften in vitro bekanntermaßen im Laufe der Zeit ändern25, ist nicht nur das aktuelle Niveau der Antigenexpression von Bedeutung, sondern auch die Variation. Diese Abweichung könnte wahrscheinlich durch eine weitgehende Einhaltung der empfohlenen Kulturbedingungen der ATCC minimiert werden. In der Praxis werden jedoch häufig institutionenabhängige Kulturbedingungen angewendet, was möglicherweise zu großen Unterschieden zwischen Institutionen führt. Um dies zu testen, haben wir die Expression mehrerer krebsbezogener Antigene auf verschiedenen Zelllinien gemessen, wenn diese unter unseren eigenen Standardkulturbedingungen kultiviert wurden, sowie auf Zellen, die an verschiedenen Institutionen unter ihren Standardkulturbedingungen kultiviert wurden.

Da CTCs insbesondere bei nicht-metastasiertem, aber auch frühem metastasiertem Krebs sehr selten sind26, ist die Messung ihrer Eigenschaften eine Herausforderung. Eine Möglichkeit, eine größere Anzahl von CTCs zu erreichen, ist die Verwendung der Leukapherese27, die die Abfrage größerer Blutmengen ermöglicht. Mit dem Ziel, ihr EpCAM-Expressionsniveau quantitativ zu messen, haben wir daher Prostatakrebs-CTCs in durch Leukapherese gewonnenen Patientenproben unter Verwendung von Nicht-EpCAM-Markern identifiziert. Darüber hinaus haben wir ihre EpCAM-Expression mit der mehrerer häufig verwendeter Krebszelllinien verglichen.

Um die Expression verschiedener Antigene zu quantifizieren, wurden die Zellen mit monoklonalen Antikörpern gefärbt, die an Phycoerythrin (PE) gekoppelt waren. Anschließend wurde die Anzahl der PE-Moleküle pro Zelle mithilfe quantitativer Durchflusszytometrie bestimmt. Obwohl die Anzahl der PE-Moleküle nicht genau der Anzahl der Antigene entspricht, werden wir in dieser Arbeit die Anzahl der PE-Moleküle pro Zelle als repräsentativ für die Anzahl der exprimierten Antigene betrachten.

Die Antigenexpression kann entweder direkt mithilfe eines Antikörpers mit einem konjugierten Fluorophor oder über einen unkonjugierten Antikörper gemessen werden, der dann mithilfe eines sekundären Antikörpers markiert wird, der an ein Fluorophor konjugiert ist. Abbildung 1A zeigt, dass die gemessene Expression in allen fünf verwendeten Zelllinien geringer ist, wenn das EpCAM-Antigen mit einem direkt konjugierten Antikörper markiert wird, verglichen mit der Verwendung einer sekundären Antikörperfärbung (Wilcoxon Signed Ranks Test, p < 0,0001). Dies ist zu erwarten, da bei Verwendung eines polyklonalen Sekundärantikörpers (z. B. Anti-Maus-PE) mehr als ein Antikörper an den Primärantikörper binden kann, was zu einem höheren PE-Signal führt. Dieses Phänomen steht im Einklang mit der Differenz im quantifizierten Ausdruck, der sich bis zu einem Faktor drei unterscheidet (Mittelwert 2,1, Bereich 0,7–3,6). Da diese Variation in allen Zelllinien zu beobachten ist, bleiben die relativen Expressionsunterschiede zwischen den Zelllinien ähnlich.

(A) EpCAM-Expression von unfixiertem PC3 (N = 11), MCF7 (N = 4), SKBR3 (N = 4) und LNCaP (N = 11), gemessen entweder unter Verwendung eines direkt konjugierten Antikörpers oder durch sekundäre Antikörperfärbung. (B) EpCAM- und Her2-Expression von LNCaP-Zellen, gemessen unter Verwendung unfixierter oder mit 1 % Formaldehyd fixierter Zellen (N = 3). (C) CK-, Her2- und EpCAM-Expression gemessen von unfixierten, CellSave-fixierten und 1 % Formaldehyd-fixierten LNCaP- und PC3-Zellen nach 24 Stunden (N = 1).

Die Zeit zwischen Probenentnahme und Antigenquantifizierung in einer Patientenprobe beträgt in unserem Fall etwa 24 Stunden, was bedeutet, dass die Antigenexpression über diesen Zeitraum erhalten bleiben sollte. In vielen Fällen wird dies durch Fixierung28 erreicht, entweder mit einem milden Fixiermittel wie CellSave (Menarini-Silicon Biosystems) oder Cytochex (Streck) oder einem härteren Fixiermittel wie Transfix (Caltag Medsystems) oder 1–4 % Formaldehyd (Merck). . Die Auswirkung einer harten Fixierung auf die gemessene Expression von EpCAM und dem humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (Her2) wurde in vier unabhängigen Experimenten bestimmt. In Abb. 1B ist zu sehen, dass bei der Zellfixierung eine signifikante Verringerung (Wilcoxon Signed Ranks Test, p = 0,002) der gemessenen Antigenexpression festgestellt wird, mit einer durchschnittlichen Abnahme von 72 % (Bereich 52–93 %). Wir haben auch die Expression von CK, Her2 und EpCAM nach 24 Stunden mit unfixierten, bei 4 °C gelagerten Zellen, CellSave-fixierten Zellen und 1 % Formaldehyd-fixierten Zellen getestet. Die Ergebnisse in Abb. 1C zeigen eine höhere konservierte Expression von EpCAM und Her2 bei Verwendung von CellSave im Vergleich zu unfixierten Zellen, während die Formaldehydfixierung zu einer starken Abnahme des intrazellulären Zytokeratins führte, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass das Permeabilisierungsmittel nicht in der Lage war, die Zellen ausreichend zu permeabilisieren. vernetzte Membran, um den Durchgang des relativ großen PE-Fluorophors zu ermöglichen.

Wir haben die Expression von EpCAM und Her2 alle zwei Monate auf Zellen der Zelllinien PC3, PC3-9 und LNCaP über einen Zeitraum von 20 Monaten (11 Messungen) und auf Zellen der Zelllinien MCF7 und SKBR3 über einen Zeitraum von 6 Monaten bestimmt (vier Messungen), Abb. 2. Hier wurden statistisch signifikante Unterschiede (p < 0,02) in der Expression von Her2 zwischen allen Kombinationen von Zelllinien gefunden, außer beim Vergleich von PC3 mit LNCaP (p = 0,17) und PC3 mit PC3-9 (p = 1) oder LNCaP mit MCF7 (p = 1). Die EpCAM-Expression zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen PC3 und PC3-9 im Vergleich zu allen anderen Zelllinien (p < 0,01). Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der EpCAM-Expression von PC3 und PC3-9 (p = 0,07), LNCaP und SKBR3 (p = 0,20), MCF7 und LNCaP (p = 1) oder MCF7 und SKBR3 (p = 0,14) gefunden, was darauf hindeutet Für diese Zelllinien ist die Variation der gemessenen Expression innerhalb derselben Zelllinie in diesem Datensatz zu groß, um den Unterschied in der Expression zwischen diesen Zelllinien deutlich zu unterscheiden.

Expression von (A) Her2 und (B) EpCAM in unfixiertem PC3, PC3-9, MCF7, SKBR3, LNCaP sowie Formaldehyd-fixiertem LNCaP, gemessen über einen Zeitraum von 6 oder 20 Monaten. Kästchen zeigen das 25.–75. Perzentil an, wobei der Median eine horizontale Linie darstellt, Whiskers zeigen das 10.–90. Perzentil an.

Um zu beurteilen, ob die innerhalb jeder Zelllinie beobachtete Variation durch Änderungen in der Antigenexpression oder durch experimentelle Variation verursacht wurde, haben wir im selben Zeitraum von 6 Monaten auch die Her2- und EpCAM-Expression an einer festen Probe von LNCaP-Zellen gemessen, siehe Abb. 2. Die mittlere Her2-Expression unfixierter LNCaP-Zellen betrug 46.523 Moleküle pro Zelle, verringerte sich jedoch um 80 % auf 9133 Antigene in der fixierten Probe (p < 0,01), was auf den Effekt der Fixierung zurückzuführen ist, wie in Abb. 1B dargestellt. Allerdings war der Variationskoeffizient (CV) der Her2-Expression für die fixierte Probe nur geringfügig höher als der der nicht fixierten Probe (37 % gegenüber 27 %). In ähnlicher Weise betrug die mittlere EpCAM-Expression nicht fixierter LNCaP-Zellen 728.738 Antigene pro Zelle und sank um 71 % auf 213.430 Antigene pro Zelle für die fixierten LNCaP-Zellen (p < 0,01). Der CV der EpCAM-Expression in der fixierten Probe (51 %) war jedoch ähnlich dem CV der nicht fixierten Probe (54 %). Der CV der Her2-Expression aller Zelllinien lag zwischen 13 und 52 % und für EpCAM zwischen 30 und 75 %.

Angesichts der ähnlichen Variation, die bei den fixierten Proben im Vergleich zu den nicht fixierten Proben beobachtet wurde, kann die Hauptursache für die gemessene Variation der Her2- und EpCAM-Expression auf Variationen in der Messung und nicht auf Veränderungen in der tatsächlichen Zelllinie zurückgeführt werden. In der ergänzenden Abbildung S1 sind dieselben Datenpunkte zeitlich dargestellt, wobei auch ein ähnliches Muster von Expressionsänderungen für mehrere Zelllinien zu erkennen ist, was damit übereinstimmt, dass die Änderungen größtenteils auf Variationen zwischen Experimenten zurückzuführen sind. Aus diesen Daten geht jedoch auch klar hervor, dass die Expressionsunterschiede zwischen diesen Zelllinien viel größer sind als die von uns gefundene Messvariabilität, was darauf hinweist, dass diese Messung zur Bestimmung des Antigen-Expressionsbereichs verwendet werden kann, auch wenn keine genauen Quantifizierungen möglich sind.

Aus Abb. 2 wird deutlich, dass es eine relativ große Variation im gemessenen Ausdruck zwischen verschiedenen Experimenten gibt, die in Abständen von etwa zwei Monaten durchgeführt werden. Um festzustellen, inwieweit sich dies auf den Vergleich der Expressionen in einem einzelnen Experiment auswirkte, haben wir die intraexperimentelle Variation bestimmt, indem wir die Expression von EpCAM und Her2 auf PC3-9- und LNCaP-Zellen unter Verwendung von dreifachen Proben innerhalb desselben Experiments und der Kurzzeitmessung gemessen haben. Termvariation zwischen Experimenten unter Verwendung von drei Wiederholungen innerhalb derselben Woche. Hierzu verwendeten wir eine Charge fixierter Zellen, um Variationen in den Kulturbedingungen zu vermeiden. Die Ergebnisse sind in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt und zeigen, dass bei am selben Tag durchgeführten Dreifachexperimenten die intraexperimentelle Variation des stark exprimierten EpCAM-Antigens in LNCaP-Zellen mit einem CV von 5,6 % relativ gering ist, bei Antigenen mit geringerer Expression jedoch zunimmt bis zu 144 % für die Her2-Expression in PC3-9. Ebenso beträgt die interexperimentelle Variation 20 % für das EpCAM-Antigen in LNCaP-Zellen und steigt auf 94 % für Her2-Antigene in PC3-9-Zellen. Dies bestätigt, dass es möglich ist, den Antigenexpressionsbereich von Zellen mit geringer Antigenexpression sowie mehrfache Veränderungen in mittel- bis hochexprimierenden Zelllinien zu bestimmen. Die Quantifizierung besonders niedriger Antigenexpressionen sollte jedoch als Bestätigung des Antigenexpressionsbereichs und nicht als sichere Bestimmung des genauen Antigenexpressionsniveaus der Zellen angesehen werden.

Viele Institutionen verwenden dieselben Zelllinien, was scheinbar einen direkten Vergleich beispielsweise immunomagnetischer Anreicherungstechnologien ermöglicht. Institutionen haben Zelllinien jedoch oft über einen längeren Zeitraum in Kultur, und im Laufe der Zeit kann die Antigenexpression dieser Zellen variieren, entweder aufgrund unterschiedlicher Kulturbedingungen oder einfach aufgrund der stochastischen Probenahme bei der Passage. Um die Unterschiede in der Expression mehrerer tumorbezogener Antigene zu messen, verglichen wir deren Expressionsniveaus auf vier Zelllinien von mindestens drei Institutionen sowie einem direkt von der American Type Culture Collection (ATCC) gekauften Fläschchen. Hierzu wurde an jedem Standort ein Aliquot der Zelllinien in flüssigem Stickstoff eingefroren und an die Universität Twente verschickt. Die Ergänzungstabelle S1 zeigt Kultivierungsdetails für jede Institution und die Durchgangszahl der Zellen zum Zeitpunkt der Messung. In den meisten Fällen verwenden Institutionen ihre eigenen Kulturmethoden, die von den Empfehlungen der ATCC abweichen können. An der Universität Twente wurden alle Kulturen einer der Zelllinien aufgetaut und etwa eine Woche lang wachsen gelassen. Anschließend wurden in einem einzigen Experiment die Antigenexpressionen aller Kulturen dieser Zelllinie bestimmt. Auf diese Weise wurden für jede Zelllinie die Antigenexpressionen aller verfügbaren Kulturen in einem einzigen Experiment gemessen.

Abbildung 3 zeigt die Histogramme des PE-Signals, gemessen mittels Durchflusszytometrie. In der ergänzenden Abbildung S3 ist die entsprechende mittlere Anzahl von Antigenen für jedes Antigen und jede Zelllinie dargestellt. Es sind mehrere Unterschiede in der Expression dieser Antigene zwischen den Kulturen zu erkennen, die in verschiedenen Einrichtungen gehalten werden, wie zum Beispiel die verringerte Expression von PSMA in der LNCaP-Zelllinie an der Universität Twente oder die große Variation in der CK-Expression in allen Zelllinien. In der CK-Expression der SKBR3- und der EpCAM-Expression der PC3-Zelllinien scheint es, dass in diesen Zelllinien die Kultur am ATCC, aus der alle anderen stammen, bereits zwei Subpopulationen enthält. Obwohl Erasmus und die Universität Twente die gleichen Kulturbedingungen für PC3 verwenden und ähnliche Passagenzahlen haben, scheint sich die Subpopulation mit hoher EpCAM-Expression am Erasmus stark vermehrt zu haben, während die Subpopulation mit niedriger Expression an der Universität Twente dominant geworden ist.

Die Expression von EpCAM, Her2, PSMA und Cytokeratin (CK) in LNCaP, MCF7, PC3 und SKBR3 vom ATCC, Erasmus MC (EMC), London Institute for Cancer Research (ICR), Universitätsklinikum Düsseldorf (UKD) und der Universität Twente ( UT). Es werden Histogramme des PE-Signals angezeigt, die mithilfe der Durchflusszytometrie gemessen wurden.

Da EpCAM das Antigen ist, das am häufigsten zum Einfangen von CTCs verwendet wird, wird erwartet, dass eine Variation in der Expression dieses Antigens zu einem Unterschied in der wahrgenommenen Einfangeffizienz von CTC-Anreicherungstechnologien führt. Um dies zu testen, haben wir Blutproben von gesunden Spendern mit einer genauen Anzahl von PC3-Zellen aus jeder der vier Institutionen versetzt. Anschließend haben wir diese Proben mit dem CellSearch-System verarbeitet und die Ausbeute an PC3-Zellen für jede Institution ermittelt.

In Abb. 4 ist die gemessene EpCAM-Expression sowie die CellSearch-Wiederherstellung von PC3-Zellen aus jedem der vier Ursprünge dargestellt. Die Ausbeute reicht von 12 % für an der Universität Twente kultivierte PC3-Zellen bis zu 83 % für am Erasmus MC kultivierte PC3-Zellen. Die lineare Regression nach Log-Transformation des EpCAM-Ausdrucks führte zu einer Regression von CSrec = − 101 + 30∙log (EpCAMexpr) mit einem R2 von 0,97. Um zu bestätigen, dass es sich bei den Zellen tatsächlich um PC3-Zellen handelt, wurde eine Short Tandem Repeat (STR)-Analyse an PC3 (UT) und PC3 (EMC) durchgeführt, um zu bestätigen, dass es sich bei diesen Zelllinien ausschließlich um PC3-Zellen (ATCC) handelt. Diese Analyse bestätigte auch, dass die verwendeten PC3-9-Zellen ein Subklon der PC3-Zelllinie sind, wie aus ihrem STR-Profil hervorgeht.

EpCAM-Expression von PC3 von ATCC, Erasmus MC (EMC), London Institute for Cancer Research (ICR) und University of Twente (UT) zusammen mit der CellSearch-Wiederherstellung jeder Zelllinie. N = 3. Der Fehlerbalken zeigt den Mittelwert ± SD an.

Wir untersuchten die EpCAM-Expression von CTCs von 13 Patienten mit metastasiertem Prostatakrebs, die sich einer diagnostischen LeukApherese (DLA) unterzogen. CTCs wurden aus DLA-abgeleiteten Proben durch immunmagnetische Abreicherung von Leukozyten mit einer Effizienz von 77,2 bis 97,1 % (Mittelwert 90,3 %, Standardabweichung 7,4 %) angereichert. Eine Übersicht über die Eingangsstichproben- und Depletionseffizienz aller Patienten ist in der Ergänzungstabelle S2 dargestellt. Nach der Erschöpfung wurden die Proben mit CD45-, CD16-, Biotin-FITC, Hoechst, Cytokeratin-APC, PSMA-PerCP/Cy5.5 und EpCAM-PE gefärbt. Nach dem Waschen wurden die Proben in 1 ml PBS/1 % BSA resuspendiert und auf einem FACS Aria II (BD Biosciences) laufen gelassen, wobei ein Hoechst-Schwellenwert verwendet wurde, um nur kernhaltige Ereignisse einzuschließen. Ein Beispiel für die durchflusszytometrische Messung ist in der ergänzenden Abbildung S4 dargestellt. Ereignisse wurden als CTC betrachtet, wenn sie negativ für CD45/CD16/Biotin und positiv für Hoechst, Zytokeratin und PSMA waren. Obwohl die Aufnahme der PSMA-Positivität in die Kriterien für die CTC-Identifizierung die Sicherheit ihrer korrekten Identifizierung erhöht, werden einige CTCs bei diesem Ansatz übersehen, da nicht alle CTCs PSMA-positiv sind. Anschließend wurde die EpCAM-Expression auf den identifizierten CTCs quantifiziert. Um zu sehen, ob die gemessenen Intensitäten direkt mit den in Zelllinienmessungen gemessenen Intensitäten verglichen werden können, wurde die Antigenexpression von PC3- und LNCaP-Zellen gemessen, nachdem Zellen mit DLA-Material versetzt wurden, und mit der direkt gemessenen Intensität derselben Zellen verglichen. Die in der ergänzenden Abbildung S5 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass es zwar einen Unterschied in der gemessenen Anzahl von Antigenen pro Zelle gibt, dieser Unterschied jedoch viel geringer ist als die Unterschiede zwischen Zelllinien sowie zwischen Zelllinien und Patienten-CTCs.

Abbildung 5A zeigt die gemessenen EpCAM-Expressionsniveaus der einzelnen CTCs, die bei 13 Prostatakrebspatienten gefunden wurden. Pro Patient wurde eine mittlere Anzahl von 15 CTCs gemessen (durchschnittlich 148 CTCs, Bereich 2–1457 CTCs). Da die EpCAM-Expression auf CTCs von Patient 12 über den Maßstab von Abb. 5A hinausgeht, wird sie in Abb. 5B auch separat im logarithmischen Maßstab dargestellt. Die gemessenen EpCAM-Ausdrücke zeigen eine große Variation, sowohl innerhalb als auch zwischen Patienten, wobei der Median pro Patient zwischen 35 und 89.534 liegt (Mittelwert 24.993, SD 28.521). In der Ergänzungstabelle S2 sind Mittelwert, Median und CV der gemessenen EpCAM-Expression aller Patienten aufgeführt. Hier wird auch die relative Wiederfindung von CTCs im Vergleich zur Menge PSMA-positiver CTCs angezeigt, die mit dem CellSearch-System gefunden wurden.

EpCAM-Expression von CTCs in Leukaphereseprodukten von 13 kastrationsempfindlichen Prostatakrebspatienten. (A) Expression der von den Patienten P1–P13 gewonnenen CTCs auf einer linearen Skala, die eine große Variation sowohl zwischen Patienten als auch innerhalb eines Patienten zeigt. (B) Expression von CTCs, die von Patient P12 auf einer logarithmischen Skala gewonnen wurden. Die Kästchen geben den Medianwert ± SD an. Aufgrund der Kompensation der Autofluoreszenz haben einige Zellen eine negative gemessene Expression erreicht.

Um zu sehen, wie die EpCAM-Expression von Patienten-CTCs mit der von häufig verwendeten Krebszelllinien zusammenhängt, haben wir die gemessene EpCAM-Expression aller Patienten-CTCs kombiniert und diese mit der EpCAM-Expression der fünf verschiedenen Krebszelllinien verglichen, die über einen Zeitraum von 6 bis 20 gemessen wurde -monatiger Zeitraum, wie in Abb. 6 dargestellt. Hier gibt jeder Kreis die gemessene EpCAM-Expression bei einem einzelnen Patienten an, während die Kreisgröße mit der Anzahl der gemessenen CTCs in Zusammenhang steht. Die angezeigten p-Werte wurden mithilfe des nichtparametrischen Kolmogorov-Smirnov-Tests ermittelt. Es ist ersichtlich, dass die PC3- und PC3-9-Zelllinien, wie sie an der Universität Twente kultiviert wurden, eine ähnliche Expression wie Patienten-CTCs zeigen, während die anderen drei Zelllinien eine viel höhere EpCAM-Expression aufweisen, was sie als CTC-Ersatz in der Bewertung ungeeignet macht von EpCAM-basierten Anreicherungs- oder Identifizierungsmethoden.

EpCAM-Expression von CTCs von 13 Prostatakrebspatienten im Vergleich zur Expression, die in fünf an der Universität Twente kultivierten Zelllinien gemessen wurde. Die Kreisposition gibt den mittleren Ausdruck pro Patient an und die Kreisgröße bezieht sich auf die Anzahl der bei jedem Patienten gemessenen CTCs. Kästchen zeigen das 25.–75. Perzentil an, wobei der Median eine horizontale Linie darstellt, Whiskers zeigen das 10.–90. Perzentil an. * zeigt einen signifikanten Unterschied an, p-Werte, bestimmt mit dem nichtparametrischen Kolmogorov-Smirnov-Test.

Die Prostatakarzinom-Zelllinien PC3 und LNCaP sowie die Brustkarzinom-Zelllinien MCF7 und SKBR3 wurden von ATCC (Manassa, VA, USA) bezogen. Die PC3-9-Zelllinie24, ein Subklon der PC3-Zelllinie, wurde freundlicherweise von Immunicon (Huntingdon Valley, PA, USA) zur Verfügung gestellt. PC3, PC3-9 und LNCaP wurden in RPMI1640 (Lonza), MCF7 und SKBR3 in DMEM (Lonza) kultiviert, alle ergänzt mit 10 % FBS (Sigma) und 1 % Pen/Strep (Lonza). Die Zellen wurden bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre kultiviert und bei Erreichen einer Konfluenz von 70–80 % mit 0,05 % Trypsin-EDTA (Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA) trypsiniert.

In dieser Studie haben wir 13 Patienten zur Messung der EpCAM-Expression auf CTCs eingeschlossen. Alle diese Patienten sind neu diagnostiziert und haben zum Zeitpunkt der Probenentnahme noch keine Behandlung erhalten. Bei diesen Patienten (Alter 60–79 Jahre, Median 70 Jahre) handelt es sich allesamt um Patienten mit metastasiertem kastrationssensitivem Prostatakrebs, die aufgrund des Vorhandenseins von > 2 CTCs in einer 7,5-ml-Blutprobe in die laufende PICTURES-Studie aufgenommen wurden. In einem der Spiking-Experimente wurde Material einer Patientin der SIBYLLA-Studie verwendet, in die Brustkrebspatientinnen einbezogen wurden, die eine adjuvante endokrine Behandlung abgeschlossen hatten und keine klinischen Anzeichen eines Wiederauftretens zeigten.

Die Leukapherese wurde mit einem Terumo Spectra Optia gemäß dem von Mout et al.29 beschriebenen optimierten Verfahren durchgeführt. Die Proben wurden gemäß der Deklaration von Helsinki im Rahmen von Studien entnommen, die von der medizinischen Ethikkommission des Erasmus Medical Center genehmigt wurden (PICTURES-Studie [MEC20-0422] und SIBYLLA-Studie [MEC20-0384]). An der Universität Twente wurden gesunde Blutproben von anonymisierten gesunden Freiwilligen in einem CellSave-Sammelröhrchen (Menarini-Silicon Biosystems) gesammelt. In Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki wurde die Einverständniserklärung aller Freiwilligen eingeholt und das verwendete Blutentnahmeverfahren wurde von der örtlichen Ethikkommission für medizinische Forschung (METC Twente) genehmigt.

Die Ausdrücke wurden an unfixierten Zellen oder, sofern angegeben, an mit CellSave oder 1 % Formaldehyd fixierten Zellen gemessen. Die Expression wurde durch Markierung des Antigens mit entweder einem unkonjugierten oder einem PE-konjugierten Antikörper für 30 Minuten bei 37 °C bestimmt. Im Fall eines unkonjugierten Antikörpers wurden die Zellen mit PBS/1 % BSA gewaschen und mit einem sekundären Anti-Maus-PE-Antikörper (12-4010-87, Fisher Scientific) 30 Minuten lang bei 37 °C gefärbt. EpCAM wurde unter Verwendung des Anti-EpCAM-Antikörpers VU1D9 gemessen, entweder unkonjugiert (freundliche Spende von Immunicon, Huntingdon Valley, PA, USA) oder PE-konjugiert VU1D9 (SAB4700425-100TST, Sigma). Die Her2-Expression wurde unter Verwendung von unkonjugiertem Her2 (freundliche Spende von Immunicon, Huntingdon Valley, PA, USA) gemessen. Die PSMA-Expression wurde mit PSMA-PE (342504, BioLegend) und die Zytokeratin-Expression mit CK11-PE (5075S, Cell Signaling Technologies) gemessen. Die gefärbten Zellen wurden dann durch Zentrifugation gewaschen und in PBS/1 % BSA resuspendiert, wonach die PE-Signalintensität von 10.000 Zellen auf einem Durchflusszytometer (FACS Aria II, BD Biosciences) gemessen wurde. Die Anzahl der PE-Moleküle pro Zelle wurde mit dem PE Fluorescent Quantitation Kit (340495, BD Biosciences) berechnet. Jedes Röhrchen dieses Kits enthält ein lyophilisiertes Perlenpellet, das mit vier bekannten PE-Konzentrationen konjugiert ist. Unter Verwendung der geometrischen Mittelintensität dieser vier Populationen haben wir eine Kalibrierungskurve gemäß den Anweisungen der Lieferanten erstellt. Anhand dieser Kalibrierungskurve haben wir dann unter Verwendung des geometrischen Mittelwerts die Anzahl der PE-Moleküle auf den gemessenen Zellen ermittelt. In Experimenten mit Proben mit sekundärer Färbung wurde die geometrische mittlere PE-Intensität einer Probe, die nur mit dem sekundären Antikörper gefärbt wurde, von den gemessenen Intensitäten abgezogen, um unspezifische Färbungen zu korrigieren. Bei Messungen mit direkt konjugierten Antikörpern wurde für diese Korrektur das Signal einer ungefärbten Probe verwendet.

Um verschiedene Kulturen derselben Zelllinien, die in verschiedenen Institutionen vorhanden sind, zu vergleichen, wurde ein Aliquot jeder Zelllinie in flüssigem Stickstoff eingefroren und an die Universität Twente geschickt, während außerdem ein neues Fläschchen jeder Zelllinie beim ATCC bestellt wurde. In der Ergänzungstabelle S1 wird eine Übersicht über die Kulturbedingungen und Passagenzahlen für jede Zelllinie und Institution angezeigt. Nach der Ankunft wurden alle Zellen etwa zwei Wochen lang in RPMI1640 (LNCaP, PC3) oder DMEM (MCF7, SKBR3) (Lonza), ergänzt mit 10 % FBS (Sigma) und 1 % Pen/Strep (Lonza), kultiviert an der Universität Twente wieder zu flüssigem Stickstoff eingefroren. Für jede Zelllinie wurden alle Kulturen gleichzeitig aufgetaut und ein bis zwei Wochen lang unter den gleichen Bedingungen kultiviert. Anschließend wurde die Expression aller Antigene in einem einzigen Experiment gemessen.

Um die Wirkung der unterschiedlichen Antigenexpressionsniveaus auf die immunmagnetische Erfassung zu veranschaulichen, haben wir eine bekannte Anzahl von PC3-Zellen aus verschiedenen Institutionen in 7,5 ml gesundes Spenderblut gegeben. Hierzu wurden PC3-Zellen mit Hoechst gefärbt und auf eine Konzentration von ca. 50 Zellen pro µL gebracht. Drei bis fünf 1-µl-Tröpfchen wurden auf einen Objektträger gegeben und abgebildet. Anhand dieser Bilder wurde die Anzahl der Zellen in jedem Tropfen nach dem Experiment manuell gezählt. Die Tröpfchen wurden mit 4 ml CellSearch-Verdünnungspuffer in eine 7,5-ml-Blutprobe gespült, wonach der Glasobjektträger auf verbleibende Zellen untersucht wurde. Die anschließende Anreicherung und Färbung erfolgte mit dem CellSearch-System (Menarini-Silicon Biosystems) mit dem regulären CTC-Kit. Zur Berechnung der Wiederherstellung wurde die Anzahl der PC3-Zellen verwendet, die nach dem Scannen und der Analyse mit dem CellTracks Analyzer II (Menarini-Silicon Biosystems) gefunden wurden.

Um die EpCAM-Expression auf CTCs von Krebspatienten zu bewerten, haben wir CTCs aus DLA-Material von 13 Prostatakrebspatienten durch Leukozytendepletion angereichert. Hierzu wurde ein Aliquot einer am Erasmus MC gewonnenen DLA-Probe mit CellSave-Konservierungsmittel fixiert und über Nacht an die Universität Twente verschickt. Auch Aliquots von 200 Millionen weißen Blutkörperchen (WBCs) wurden am Erasmus MC mit dem CellSearch-System verarbeitet. Hier wurde PSMA als zusätzlicher Marker hinzugefügt, was den Vergleich der Anzahl der nach Leukozytendepletion gefundenen DAPI + CK + PSMA + CD45-CTCs mit der mit dem CellSearch-System gefundenen Anzahl ermöglicht. Für die an der Universität Twente durchgeführte Abreicherung wurde ein Probenaliquot bestehend aus durchschnittlich 530 × 106 Leukozyten (Bereich 230 × 106 bis 842 × 106 Leukozyten) mit CD45-Biotin (4 µg/ml, hergestellt und gekoppelt in unserer Einrichtung) inkubiert ), CD2-Biotin (555325 BD Pharmingen), CD16-Biotin (555405 BD Pharmingen) und CD19-Biotin (555411 BD Pharmingen) für 15 Min. Nach der Zugabe von 9 ml Kaseinpuffer (7 mM Natriumphosphat, 41,5 mM Natriumchlorid, 0,1 % Natriumazid, 50 mM EDTA, 0,5 % BSA, 0,2 % Mäuseserum, 0,5 % Kasein, pH = 7,5) wurde die Probe gewaschen 10 Minuten lang bei 800 G zentrifugiert und in 6 ml Kaseinpuffer resuspendiert. Dazu wurden Streptavidin-Ferrofluide gegeben (18 µg/ml, BioMagnetic Solutions) und die Probe wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Trennung der gebundenen Zellen wurde erreicht, indem die Probe 10 Minuten lang in einen Quadrupolmagneten gegeben wurde. Anschließend wurde die ungebundene Fraktion mit einer Glaspasteurpipette entfernt, die an eine Spritzenpumpe (Harvard Apparatus) angeschlossen war. Die Pasteurpipette wurde in der Mitte des Röhrchens platziert und das Absaugen erfolgte mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min. Magnetische Inkubation und Aspiration wurden bei Bedarf mehrmals wiederholt, um einen ausreichenden Verarmungsgrad zu erreichen. Zur Identifizierung von CTCs wurde die abgereicherte Probe mit einem Färbecocktail bestehend aus Hoechst (H3570, Invitrogen) zur Färbung aller Zellen, CK11-APC (1A-108-C100, Exbio), PSMA-PerCP/Cy5.5 (342512, BioLegend) und VU1D9-PE (SAB4700425-100TST, Sigma) zur positiven Identifizierung von CTCs und CD45-FITC (11-0459-42, eBioscience), CD16-FITC (302.006, BioLegend) und Streptavidin-FITC (S3762- 0,1 mg, Merck), um die verbleibenden weißen Blutkörperchen in der erschöpften Probe anzufärben. Hier wird das Streptavidin-FITC verwendet, um jegliches CD2-, CD16-, CD19- oder CD45-Biotin anzufärben, das während des Depletionsverfahrens an die Zellen gekoppelt wurde und nicht mit einem Magnetpartikel markiert wurde. Alle Färbereagenzien wurden in einem Puffer mit 0,05 % Saponin kombiniert, um die Zellen zu permeabilisieren. Es wurden mehrere Kontrollen mitgenommen, um eine korrekte Kompensation und Ansteuerung zu ermöglichen (LNCaP und PC3-9, gefärbt mit CK11, PSMA, VU1D9 bzw. Hoechst; DLA, gefärbt mit CD45/CD16/Streptavidin bzw. Hoechst; ungefärbte Proben von DLA, LNCaP und PC3 -9). Die gefärbten Zellen wurden dann gewaschen und in PBS/1 % BSA resuspendiert und die Fluoreszenzintensität wurde mit einem Durchflusszytometer (FACS Aria II, BD Biosciences) gemessen. CTCs wurden als CD45/CD16/Strep−, CK/PSMA+-Zellen identifiziert. Das EpCAM-PE-Signal wurde mit dem PE Fluorescent Quantitation Kit (340495, BD Biosciences) quantifiziert, siehe auch ergänzende Abbildung S4. Da erwartet wird, dass das Verfahren zur Abreicherung, der große Hintergrund unerwünschter Zellen sowie die höhere Komplexität des Färbemixes die gemessene EpCAM-Expression beeinflussen, haben wir DLA von Prostata- (PICTURES-Studie) oder Brustkrebspatientinnen (SIBYLLA-Studie) mit ca 10.000 PC3- oder LNCaP-Zellen vor der Durchführung des Abreicherungs- und Färbeverfahrens untersucht und die gemessenen Ausdrücke der gespikten Zellen mit denen von nicht gespikten Zellen verglichen, die im selben Experiment gemessen wurden.

Die Korrelation zwischen der EpCAM-Expression und der CellSearch-Wiederherstellung wurde nach Log-Transformation der EpCAM-Expression bestimmt.

Um eine Normalverteilung zu erhalten, wurden die logarithmisch normalverteilten Antigenexpressionen logarithmisch transformiert und unter Verwendung einer Einweg-ANOVA verglichen. Da der Levene-Test eine homogene Varianz anzeigte, führten wir den Bonferroni-Test durch, um statistische Unterschiede zwischen allen Gruppen zu ermitteln.

Beim Vergleich der Antigenexpression zwischen einem einzelnen Paar wurde ein Zwei-Proben-t-Test mit logarithmisch transformierten Daten durchgeführt.

In Fällen, in denen gepaarte Proben aus verschiedenen Zelllinien, Antigenen oder Präparationsmethoden gruppiert wurden, wurden statistische Unterschiede mithilfe des nichtparametrischen Wilcoxon Signed Rank Test ermittelt.

Um die EpCAM-Expression von CTCs mit der verschiedener Zelllinien zu vergleichen, wurde der nichtparametrische Kolmogorov-Smirnov-Test für ungepaarte Proben verwendet. Alle statistischen Analysen und Korrelationsanalysen wurden mit Origin 2019b (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA) durchgeführt und ein Signifikanzschwellenwert von 0,05 verwendet.

Die Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von den Ethikkommissionen der Studien PICTURES (MEC 20-0422) und SIBYLLA (MEC 20-0384) genehmigt.

Von allen an der Studie beteiligten Probanden wurde eine Einverständniserklärung eingeholt.

Um Antigen-Anreicherungsassays effektiv entwickeln, vergleichen und testen zu können, muss die Antigenexpression des verwendeten CTC-Ersatzes reale CTCs realistisch darstellen. Das wichtigste Merkmal ist dabei die Expression des Zielantigens. Wir haben die Expression des oft gezielten EpCAM-Antigens in CTCs von Prostatakrebspatienten mit der EpCAM-Expression mehrerer bekannter Zelllinien mithilfe quantitativer Durchflusszytometrie verglichen. Hier ist es wichtig zu wissen, dass die mithilfe der quantitativen Durchflusszytometrie gemessene Expression eines Antigens von einer Vielzahl von Faktoren abhängt, von denen wir nur eine begrenzte Anzahl gezeigt haben. Einer dieser Faktoren ist das Verhältnis zwischen der Anzahl der an eine Zelle gebundenen fluoreszierenden Moleküle und der tatsächlichen Anzahl der Antigene. Dieses Verhältnis wird durch die Markierungseffizienz des Antikörpers sowie die Anzahl der fluoreszierenden Moleküle pro Antikörper-Fluorophor-Konjugat bestimmt. Ersteres hängt von mehreren Faktoren ab, darunter dem verwendeten Antikörperklon, der Antikörperkonzentration, der Inkubationszeit und der Inkubationstemperatur, eine vollständige Markierung wird jedoch nie erreicht30. Letzteres lässt sich am Unterschied zwischen direkter und sekundärer Antikörperfärbung erkennen (Abb. 1A).

Obwohl unfixierte Zellen die beste Methode zur Messung jeglicher Zelleigenschaften darstellen, werden Patientenproben in der Praxis häufig am nächsten Tag verarbeitet. In dieser Hinsicht hat sich die Verwendung eines milden Fixiermittels wie CellSave als gute Möglichkeit zur Erhaltung der Antigenexpression erwiesen, während eine stärkere Fixierung (Formaldehyd) die Antigene für den Nachweisantikörper weniger zugänglich zu machen scheint. Darüber hinaus führt eine stärkere Fixierung dazu, dass die Permeabilisierung mit 0,05 % Saponin unwirksam ist und eine intrazelluläre Färbung verhindert wird.

Da die in CTCs gemessenen EpCAM-Expressionen relativ gering sind, wird erwartet, dass die experimentelle Variation zwischen diesen Messungen auch der für PC3-9 beobachteten ähnelt (ergänzende Abbildung S2). Der gemessene Expressionsbereich ist jedoch relevant, wenn man bedenkt, dass die Variation in Die zwischen Patienten beobachtete EpCAM-Expression ist immer noch viel geringer als die EpCAM-Expressionsunterschiede zwischen Patienten-CTC und einigen der getesteten Zelllinien.

Darüber hinaus deuten die bei der Messung fester Zellen beobachteten Abweichungen bei den unabhängigen Messungen in längeren Zeitintervallen darauf hin, dass es auch experimentelle Abweichungen gibt. Da jedoch die CTCs der Patienten zu 13 verschiedenen Zeitpunkten im selben Zeitraum wie die Zelllinienexpressionen gemessen wurden, ist zu erwarten, dass die Auswirkung dieser experimentellen Variation auf beide Messreihen vergleichbar ist.

Es wurden mehrere Unterschiede in den Expressionsprofilen derselben Zelllinien gefunden, die in verschiedenen Institutionen kultiviert wurden, in einigen Fällen trotz ähnlicher Passagenzahl und Kultivierung mit demselben Kulturmedium. Die Verbreitung verschiedener Subtypen von PC3-Zellen beispielsweise an der Erasmus-Universität und der Universität Twente zeigt, dass die Verwendung desselben Kulturmediums nicht der einzige wichtige Faktor ist. Wahrscheinlich sind auch andere Faktoren wie die Durchgangsrate, die Impfdichte und der Typ der Kulturflasche von Einfluss.

Einige der CTCs zeigen eine gemessene EpCAM-Expression unter Null. Dies ist auf die Korrektur des im Durchflusszytometer vorhandenen Hintergrundsignals zurückzuführen. Da wir für jede Zelle eine feste Korrektur anwenden, die auf der geometrischen mittleren Intensität der Negativkontrollprobe basiert, ist diese Korrektur für etwa die Hälfte der Zellen größer als ihr tatsächliches Hintergrundsignal, was in einigen Fällen dazu führt, dass die berechnete Menge an PE-Molekülen pro Zelle sinkt Zelle wird negativ. Ebenso wird etwa die Hälfte der Zellen weniger stark korrigiert als ihr tatsächliches Hintergrundsignal. Um die Variation gleichmäßig zu verteilen, haben wir uns entschieden, diese negativen Werte nicht auf Null zu setzen.

Wie in Abb. 6 zu sehen ist, ist die EpCAM-Expression von PC3- und PC3-9-Zellen unter den getesteten Zelllinien der von CTCs, die von Prostatakrebspatienten stammen, am ähnlichsten. Die einzige andere Studie, die unseres Wissens nach versucht hat, die EpCAM-Expression auf CTCs quantitativ zu messen, ist die von Rao et al.24. Ihre Ergebnisse zeigen eine höhere gemessene EpCAM-Expression (49.708 Antigene pro Zelle) im Vergleich zu unseren Ergebnissen. Diese Ausdrücke können jedoch nicht direkt verglichen werden, da Rao et al. verwendeten nicht nur CTCs von Prostatakrebspatienten, sondern verwendeten bei ihrer CTC-Auswahl auch einen minimalen EpCAM-Expressionsschwellenwert, wodurch alle EpCAM-negativen CTCs effektiv ausgeschlossen wurden. Interessanterweise stellten sie jedoch auch fest, dass die EpCAM-Expression der PC3-9-Zelllinie als CTC-Vertreter geeignet ist, was zum Teil darauf zurückzuführen ist, dass ihre Kultur von PC3-9-Zellen im Vergleich zu unserer Kultur eine höhere EpCAM-Expression aufweist.

Wenn man die EpCAM-Expression von CTCs mithilfe der in Abb. 4 dargestellten linearen Regression mit der CellSearch-Wiederherstellung in Beziehung setzt, wird deutlich, dass die erwartete Wiederherstellung von CTCs für einige Patienten allein auf der Grundlage ihrer EpCAM-Expression im Bereich von 1–5 % liegt. In früheren Studien haben wir weitere CTCs im Abfall des CellSearch-Systems13 entdeckt, jedoch nicht in diesem Ausmaß. Wir gehen davon aus, dass der Grund dafür darin liegt, dass die CellSearch-Wiederherstellung nicht nur von der EpCAM-Expression abhängt, sondern dass auch andere Eigenschaften wie die Größe für die immunmagnetische Erfassung von CTCs wichtig sind. Um eingefangen zu werden, benötigen die relativ großen PC3-Zellen daher wahrscheinlich eine stärkere EpCAM-Expression als ein durchschnittlich kleinerer Prostatakrebs-CTC.

In diesem Zusammenhang erwarteten wir auch eine Korrelation zwischen der EpCAM-Expression und der relativen Erholung von CTCs unter Verwendung eines Depletion-Ansatzes im Vergleich zur CellSearch-Anreicherung. Bei den 13 gemessenen Patienten haben wir einen solchen Zusammenhang jedoch nicht beobachtet (siehe Daten in der Ergänzungstabelle S2). Dies ist wahrscheinlich teilweise auf die Ungewissheit über den genauen Grad der EpCAM-Expression bei diesen Patienten sowie auf eine Variation des CTC-Verlusts während der Abreicherungs- und Färbeverfahren zurückzuführen. Ein weiterer Faktor, der dazu führen kann, dass bei manchen Patienten mit dem Durchflusszytometer mehr CTCs gemessen werden, ist seine höhere Empfindlichkeit, die dazu führt, dass Zellen mit gleicher PSMA-Expression in CellSearch als PSMA-negativ bewertet werden, während sie in der empfindlicheren Durchflusszytometrie-Messung als positiv gelten.

Obwohl dies offensichtlich nicht der einzige wichtige Faktor ist, sollte man bei der Auswahl einer Zelllinie zur Optimierung darauf abzielen, eine oder mehrere Zelllinien im Expressionsbereich zu verwenden, der in echten CTCs gemessen wird. Wie in Abb. 3 zu sehen ist, bedeutet dies nicht, dass von der ATCC gekaufte PC3-Zellen als niedrig exprimierendes CTC-Äquivalent geeignet sind, da ihre Expression an der Spitze dessen liegt, was in echten CTCs gemessen wird. Dieser Unterschied zeigt auch die Notwendigkeit einer regelmäßigen Quantifizierung der Antigenexpression, wenn Vergleiche anhand von Zelllinien durchgeführt werden sollen.

In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass der Vergleich antigenbasierter Zellanreicherungsmethoden an verschiedenen Institutionen, die dieselben Zelllinien verwenden, zu großen Unterschieden in der Einfangeffizienz führen kann, da an verschiedenen Institutionen kultivierte Zelllinien große Unterschiede in der Antigenexpression aufweisen. Idealerweise wird eine Zelllinie verwendet, deren Expression mit echten CTCs vergleichbar ist. Für EpCAM zeigen wir eine Expression auf CTCs, die sich bei kastrationsempfindlichen Prostatakrebspatienten unterscheidet, aber viel geringer ist als bei vielen der Zelllinien, die häufig zur Bewertung von CTC-Anreicherungstechnologien verwendet werden.

Die während der aktuellen Studie generierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Alle in diesem Manuskript verwendeten Durchflusszytometriedaten sind im Standard-FCS-Dateiformat verfügbar. Bilder, die zum Zählen der versetzten Zellen verwendet werden, sowie die CellSearch-Scans, die zur Bewertung der Wiederherstellung verwendet werden, sind im ursprünglichen .tiff-Format verfügbar.

Zhang, Y., Li, Y. & Tan, Z. Ein Überblick über Anreicherungsmethoden für zirkulierende Tumorzellen: Von der Einzelmodalität zur Hybridmodalität. Analyst 146, 7048–7069 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Rushton, AJ, Nteliopoulos, G., Shaw, JA & Coombes, RC Ein Überblick über Technologien zur Anreicherung zirkulierender Tumorzellen. Krebserkrankungen (Basel). 13, 1–33 (2021).

Artikel Google Scholar

Bankó, P. et al. Technologien zur Trennung zirkulierender Tumorzellen aus Vollblut. J. Hämatol. Oncol. 12, 48 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

He, S., Wei, J., Ding, L., Yang, X. & Wu, Y. Modernste Techniken und sich aktuell entwickelnde Ansätze zur Trennung und Erkennung zirkulierender Tumorzellen. Talanta 239, 123024 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liu, P., Jonkheijm, P., Terstappen, LWMM & Stevens, M. Magnetische Partikel für die CTC-Anreicherung. Krebserkrankungen (Basel). 12, 1–26 (2020).

Artikel Google Scholar

Eslami-S, Z., Cortés-Hernández, LE & Alix-Panabières, C. Epithelzelladhäsionsmolekül: Ein Anker zur Isolierung klinisch relevanter zirkulierender Tumorzellen. Zellen 9(8), 1836. https://doi.org/10.3390/cells9081836 (2020).

Coumans, F. & Terstappen, L. Erkennung und Charakterisierung zirkulierender Tumorzellen durch den CellSearch-Ansatz BT – Whole Genome Amplification: Methoden und Protokolle. in (Hrsg. Kroneis, T.) 263–278 (Springer New York, 2015). https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2990-0_18.

Lazar, DC et al. Zytometrische Vergleiche zwischen zirkulierenden Tumorzellen von Prostatakrebspatienten und der aus Prostatatumoren stammenden LNCaP-Zelllinie. Physik. Biol. 9, 016002. https://doi.org/10.1088/1478-3975/9/1/016002 (2012).

De Wit, S. et al. Der Nachweis von EpCAM+ und EpCAM– zirkulierenden Tumorzellen. Wissenschaft. Rep. 5, 12270. https://doi.org/10.1038/srep12270 (2015).

Mikolajczyk, SD et al. Nachweis von EpCAM-negativen und Cytokeratin-negativen zirkulierenden Tumorzellen im peripheren Blut. J. Oncol. 2011, 252361. https://doi.org/10.1155/2011/252361 (2011).

Schneck, H. et al. EpCAM-unabhängige Anreicherung zirkulierender Tumorzellen bei metastasiertem Brustkrebs. PLoS ONE 10, 1–23 (2015).

Artikel Google Scholar

Brungs, D. et al. Etablierung neuartiger Langzeitkulturen aus EpCAM-positiven und -negativen zirkulierenden Tumorzellen von Patienten mit metastasiertem gastroösophagealen Krebs. Wissenschaft. Rep. 10, 539 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

De Wit, S. et al. EpCAMhigh und EpCAMlow zirkulierende Tumorzellen bei metastasierten Prostata- und Brustkrebspatientinnen. Oncotarget 9, 35705–35716 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Beck, TN et al. Zirkulierende Tumorzellen und zellfreie RNA-Einfang- und Expressionsanalyse identifizieren Thrombozyten-assoziierte Gene bei metastasiertem Lungenkrebs. BMC Cancer 19, 1–13 (2019).

Artikel Google Scholar

Wu, J. et al. Magnetische Anreicherung seltener Zellen aus hochkonzentrierten Blutproben. Krebserkrankungen (Basel). 12, 933 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, P., Huang, YY, Hoshino, K. & Zhang, JXJ Mikroskalige Magnetfeldmodulation zur verbesserten Erfassung und Verteilung seltener zirkulierender Tumorzellen. Wissenschaft. Rep. 5, 1–9 (2015).

Google Scholar

Stevens, M. et al. Optimale Halbach-Konfiguration für die Durchfluss-immunmagnetische CTC-Anreicherung. Diagnostics 11(6), 1020. https://doi.org/10.3390/diagnostics11061020 (2021).

Sun, C. et al. Paramagnetische Strukturen innerhalb eines Mikrofluidikkanals für eine verbesserte immunomagnetische Isolierung und Oberflächenstrukturierung von Zellen. Wissenschaft. Rep. 6, 1–9 (2016).

MathSciNet Google Scholar

Gabriel, MT, Calleja, LR, Chalopin, A., Ory, B. & Heymann, D. Zirkulierende Tumorzellen: Eine Übersicht über nicht-EpCAM-basierte Ansätze zur Zellanreicherung und -isolierung. Klin. Chem. 62, 571–581 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liberti, PA, Rao, GC und Terstappen, LWMM Erhöhte Trenneffizienz durch kontrollierte Aggregation magnetischer Nanopartikel. Immunivest. Corp. https://doi.org/10.1016/S0304-8853(00)01254-3 (1999).

Bhagwat, N. et al. Eine integrierte durchflusszytometriebasierte Plattform zur Isolierung und molekularen Charakterisierung zirkulierender Tumoreinzelzellen und -cluster. Wissenschaft. Rep. 8, 1–14 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Zhou, J. et al. Epithel-mesenchymaler Übergangsstatus zirkulierender Tumorzellen bei Brustkrebs und seine klinische Relevanz. Krebsbiol. Med. 17, 169–180 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sieuwerts, AM et al. Antikörper gegen epitheliale Zelladhäsionsmoleküle und Nachweis von zirkulierenden normalähnlichen Brusttumorzellen. J. Natl. Krebsinst. 101, 61–66 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rao, GC et al. Expression von Epithelzelladhäsionsmolekülen in Karzinomzellen im Blut sowie in primären und metastatischen Tumoren. Int. J. Oncol. 27, 49–57 (2005).

CAS PubMed Google Scholar

Yu, Y. et al. Charakterisierung langfristiger in-vitro-kulturbedingter Veränderungen von aus menschlichen Tonsillen stammenden mesenchymalen Stammzellen: Rolle von CCN1 bei der replikativen Seneszenz-assoziierten Steigerung der osteogenen Differenzierung. J. Anat. 225, 510–518 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thalgott, M. et al. Nachweis zirkulierender Tumorzellen in verschiedenen Stadien von Prostatakrebs. J. Cancer Res. Klin. Oncol. 139, 755–763 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Fischer, JC et al. Die diagnostische Leukapherese ermöglicht den zuverlässigen Nachweis zirkulierender Tumorzellen bei nicht metastasierten Krebspatienten. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 110, 16580–16585 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Harrison, D. et al. Ringvergleich des TransFix®/EDTA Vakuum-Blutentnahmeröhrchens mit dem 5 ml Cyto-Chex® BCT. Zytometrie B. Clin. Zytom. 96, 496–507 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mout, L. et al. Erzeugung menschlicher Prostatakrebs-Organoide aus durch Leukapherese angereicherten zirkulierenden Tumorzellen. EUR. J. Krebs 150, 179–189 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hummert, J., Tashev, SA & Herten, D.-P. Ein Update zur Molekülzählung in der Fluoreszenzmikroskopie. Int. J. Biochem. Zellbiol. 135, 105978 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken dem Erasmus MC Rotterdam, dem London Institute for Cancer Research und dem Universitätsklinikum Düsseldorf für die Bereitstellung mehrerer Brust- und Prostatakrebszelllinien. Wir danken auch dem Erasmus MC Rotterdam für die Bereitstellung eines Probenaliquots aus der SIBYLLA-Studie. Wir danken dem GEDNAP Proficiency Tests Institute for Forensic Science (Münster) für die Durchführung der STR-Analyse.

Diese Forschung wurde teilweise durch das NWO/KWF PICTURES-Programm (17915) unterstützt.

Medical Cell Biophysics Group, Techmed Center, Fakultät für Naturwissenschaften und Technologie, Universität Twente, Postfach 217, 7500 AE, Enschede, Niederlande

Anouk Mentink, Leon WMM Terstappen und Michiel Stevens

Abteilung für Medizinische Onkologie, Erasmus MC Cancer Institute, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, Niederlande

Khrystany T. Isebia & Jaco Kraan

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Konzeptualisierung, LT; Design, AM, MS, LT; Analyse, AM, MS; Akquisition, AM, KTI, JK, MS; Schreiben, AM, MS; Überprüfung und Bearbeitung, AM, KTI, JK, LT, MS; Visualisierung, AM, MS; Supervision, MS, LT

Korrespondenz mit Michiel Stevens.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Mentink, A., Isebia, KT, Kraan, J. et al. Messung der Antigenexpression von Krebszelllinien und zirkulierenden Tumorzellen. Sci Rep 13, 6051 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33179-y

Zitat herunterladen

Eingegangen: 02. Dezember 2022

Angenommen: 08. April 2023

Veröffentlicht: 13. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33179-y

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.