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Mar 18, 2023

25OHD-Analoga und Vakuum-Blutentnahmeröhrchen beeinträchtigen die Genauigkeit automatisierter Immunoassays erheblich

Wissenschaftliche Berichte Band 5,

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 14636 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Schwankungen bei den Vitamin-D-Quantifizierungsmethoden sind groß und der Einfluss von Vitamin-D-Analoga und Blutentnahmemethoden wurde nicht systematisch untersucht. Wir haben die Auswirkungen der Vitamin-D-Analoga 25OHD2 und 3-epi 25OHD3 sowie Blutentnahmemethoden auf die Vitamin-D-Messung mithilfe von fünf Immunoassay-Systemen und Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) untersucht. Serumproben (332) wurden aus routinemäßigen Vitamin-D-Assay-Anfragen ausgewählt, darunter Proben mit oder ohne 25OHD2 oder 3-epi 25OHD3, und mithilfe verschiedener Immunoassay-Systeme analysiert. In Proben ohne 25OHD2 oder 3-epi 25OHD3 korrelierten alle Immunoassays gut mit LC-MS/MS. Das Siemens-System erzeugte jedoch eine große positive mittlere Abweichung von 12,5 ng/ml und einen schlechten Kappa-Wert, wenn Röhrchen mit Gerinnungsaktivator und Gelseparator verwendet wurden. Wenn 25OHD2 oder 3-epi 25OHD3 vorhanden waren, verringerten sich die Korrelationen und die klinische Übereinstimmung bei allen Immunoassays. Serum 25OHD in VACUETTE-Röhrchen mit Gel und Gerinnungsaktivator ergab, gemessen mit dem Siemens-System, deutlich höhere Werte als Proben, die in VACUETTE-Röhrchen ohne Zusatzstoffe gesammelt wurden. Bei der Verwendung von Röhrchen ohne Zusatzstoffe nahm der Bias ab und die klinische Übereinstimmung verbesserte sich deutlich. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die meisten automatisierten Immunoassays eine akzeptable Korrelation und Übereinstimmung mit LC-MS/MS zeigten; Allerdings beeinträchtigten 25OHD-Analoga und Blutentnahmeröhrchen die Genauigkeit erheblich.

Jüngste Beweise für den Zusammenhang zwischen Vitamin D und Knochenerkrankungen1, Diabetes2, Autoimmunerkrankungen3, Herz-Kreislauf-Erkrankungen4 und Krebs5 sowie die Erkenntnis, dass Vitamin-D-Mangel weit verbreitet ist, haben weltweit zu einem massiven Anstieg von Vitamin-D-Tests geführt1,6,7. Beispielsweise haben in der Mayo-Klinik die Tests auf Vitamin-D-Mangel um 80–90 % pro Jahr zugenommen6 und in unserem Labor hat sich die Anzahl der durchgeführten Tests innerhalb der letzten zwei Jahre verdoppelt. Aufgrund dieser erhöhten Arbeitsbelastung wurden kürzlich automatisierte Immunoassays entwickelt. Allerdings gibt es große Unterschiede zwischen den Methoden zur Bestimmung des Vitamin-D-Spiegels6,8,9.

Zirkulierendes 25-Hydroxyvitamin D (25OHD) ist die vorherrschende Form von Vitamin D und gilt allgemein als der zuverlässigste Biomarker für die Vitamin-D-Konzentration im Serum10. 25OHD3 und 25OHD2 sind die beiden Haupttypen von 25OHD: 25OHD3 wird bei Tieren endogen in der Haut als Reaktion auf Sonneneinstrahlung produziert und kann über 25OHD3-haltige Nahrungsergänzungsmittel mit der Nahrung aufgenommen werden. 25OHD2 kommt in Pilzen vor. Entweder 25OHD2 oder D3 können in Nahrungsergänzungsmitteln oder als Zusatz zu Lebensmitteln wie Milchprodukten1 verwendet werden. Kürzlich wurde jedoch 3-epi 25OHD3, ein Epimer von 25OHD3, identifiziert. Während die Bioaktivität dieses Analogons noch unklar ist11,12, wurde in Immunoassays gezeigt, dass 3-epi 25OHD3 eine Kreuzreaktivität mit 25OHD3 verursacht, was zu einer Überschätzung der 25OHD-Spiegel führt.

Für den Nachweis von 25OHD wurden verschiedene automatisierte Immunoassays entwickelt. Es wurde jedoch berichtet, dass die Abweichung zwischen Laboratorien bis zu 38 % beträgt6,8,13. Darüber hinaus ist die Definition von Vitamin-D-Mangel immer noch umstritten, wobei große Unterschiede zwischen den Methoden zu der Kontroverse beitragen. Man geht davon aus, dass solche großen Schwankungen auch für klinische Diagnoseanwendungen problematisch sein werden, wenn für verschiedene Methoden derselbe Grenzwert für Vitamin-D-Mangel verwendet wird. Daher sollte die klinische Einheitlichkeit der verschiedenen Methoden bewertet werden.

Isotopenverdünnungs-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) gilt als Goldstandard und Referenzmethode für 25OHD-Tests14. Die am häufigsten verwendeten LC-MS/MS-Ansätze und diejenigen, die die Grundlage für den Methodenvergleich bildeten, umfassten jedoch nicht die Trennung von 3-epi 25OHD3 von 25OHD3, da dies eine zeitaufwändige Analyse mittels Chromatographie erfordern würde, was die Nachweiseffizienz verringern würde; nur in vereinzelten Studien wurde 3-epi 25OHD3 mittels LC-MS/MS14,15 gemessen.

In mehreren Studien wurden in den letzten Jahren Methoden zum Vitamin-D-Nachweis verglichen; Ob solche Methoden jedoch den Leistungsstandards genügen, ist umstritten. Im Jahr 2012 verglichen Farrell et al.8 die Leistung von fünf automatisierten Immunoassays mit LC-MS/MS und kamen zu dem Schluss, dass das Roche-System die Mindestleistungsziele nicht erfüllte, während Ajuria-Morentin et al.9 berichteten, dass das Siemens-System dies tat größte Verzerrung im Vergleich zu LC-MS/MS, ohne klare Erklärung für diese Verzerrung. Sowohl Vitamin-D2- als auch Vitamin-D3-Ergänzungsmittel werden in China und den Vereinigten Staaten von Amerika (USA) häufig verwendet. Die Feststellung erheblicher Konzentrationen an zirkulierendem 25OHD2 und 3-epi 25OHD311 hat einige Hersteller wie Roche dazu veranlasst, ihre Produkte zu aktualisieren, um sie zu verbessern Nachweis- und Quantifizierungseffizienz für verschiedene Analoga. Diese neuartigen Immunoassays können jedoch durch die Kreuzreaktivität der Antikörper und die nicht äquimolare Erkennung von 25OHD2 und 25OHD3 eingeschränkt sein. Darüber hinaus wurden in keiner Studie die Auswirkungen von 25OHD2 und 3-epi 25OHD3 auf die Leistung der neuesten Generation von 25OHD-Immunoassaysystemen untersucht. Als zusätzliche Komplikation einer genauen 25OHD-Messung ist die Verwendung von Vakuum-Blutentnahmeröhrchen nicht standardisiert und unterschiedliche Entnahmeröhrchen können die Genauigkeit von Immunoassays beeinträchtigen.

In dieser Studie verglichen wir fünf automatisierte Immunoassays, darunter Roche Cobas E601 (Roche Diagnostics (Shanghai) Ltd., Basel, Schweiz), Siemens ADVIA Centaur XP (Siemens Healthcare Diagnostics (Shanghai) Co., Walpole, USA), DiaSorin Liaison XL ( DiaSorin, Saluggia, Italien), Abbott Architect I4000 (Abbott Diagnostics, Deerfield, IL, USA) und IDS-iSYS (IDS France, Pouilly en Auxois, Frankreich) mit einer Referenz-LC-MS/MS-Methode zur Bewertung der Auswirkungen von 25OHD2 und 3-epi 25OHD3 zur Genauigkeit der fünf automatisierten Immunoassays und zur Bestimmung des Einflusses von Zusatzstoffen in Vakuum-Blutentnahmeröhrchen auf den Nachweis von 25OHD.

Von April bis Juni 2014 wurden 332 Serumproben von 106 Männern und 226 Frauen im Alter von 6 Monaten bis 93 Jahren (Mittelwert ± SD; 46 ± 22 Jahre alt) im Rahmen routinemäßiger Vitamin-D-Assay-Anfragen entnommen. Die Proben wurden mit VACUETTE 4-ml-Röhrchen mit Gel und Gerinnungsaktivator (REF: 454067; Greiner Bio-one, Kremsmünster, Österreich) gesammelt, darunter 166 Serumproben mit 25OHD3 (4,3–57,4 ng/ml), 111 Serumproben mit 25OHD2 ( 2,5–78,4 ng/ml), 31 Serumproben mit 3-epi 25OHD3 (2,2–8,8 ng/ml) und 24 Proben mit sowohl 25OHD2 (3,2–18,8 ng/ml) als auch 3-epi 25OHD3 (2,2–5,4 ng/ml). ) sowie 25OHD3. Zum Zeitpunkt dieser Studie wurde in unserem Labor LC-MS/MS eingesetzt und diente der Auswahl der Proben für diese Studie. Serumproben wurden in sechs Aliquots aufgeteilt und bei –80 °C gelagert, um die Stabilität bis zur Analyse sicherzustellen16,17.

Zur Untersuchung der möglichen Auswirkungen von Zusatzstoffen in Vakuum-Blutentnahmeröhrchen auf die 25OHD-Messung wurden 77 gesunde Freiwillige rekrutiert und von jedem Einzelnen wurden Nüchternblutproben durch Venenpunktion in VACUETTE 4-ml-Röhrchen ohne Zusatzstoffe (REF: 454001; Greiner Bio-) entnommen. eins); Die Proben wurden dann innerhalb von 2 Stunden (1200 × g, 10 Minuten) zentrifugiert und sofort mithilfe automatisierter Immunoassay-Systeme und LC-MS/MS analysiert.

Wir verwendeten LC-MS/MS zur Messung von 25OHD und zur Bewertung der fünf automatisierten Chemilumineszenz-Immunoassay-Systeme. Darüber hinaus wurden drei Serumpools zur Beurteilung der Testpräzision vorbereitet. Die LC-MS/MS-Methode ergab für die drei Pools mittlere 25OHD-Konzentrationen von 6,2, 16,0 bzw. 22,1 ng/ml, wobei die Konzentrationen von 25OHD2 und 3-epi 25OHD3 weniger als 2,5 ng/ml betrugen. Aus den drei Pools wurden mehrere Aliquots hergestellt und bei –80 °C gelagert. An fünf aufeinanderfolgenden Tagen wurde ein frisch aufgetautes Aliquot jedes Pools viermal mit allen Methoden getestet.

Die Studie wurde von der Ethikkommission des Peking Union Medical College Hospital überprüft und genehmigt und die Experimente wurden gemäß den genehmigten Richtlinien durchgeführt. Alle untersuchten Personen wurden schriftlich über die beabsichtigte Verwendung ihrer Proben informiert und gaben jeweils eine schriftliche Einwilligung.

LC-MS/MS wurde unter Verwendung eines Waters ACQUITY UPLC-Systems (Waters Corporation, Milford, MA, USA) zusammen mit einem AB Sciex 4000 QTrap-System (Sciex Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Das Protokoll zur Probenvorbereitung war wie folgt. Serumproben, Kalibratoren und Kontrollen wurden mit 0,1 mM Natriumhydroxid behandelt und mit 1 mM Zinksulfatlösung und Methanol, das interne Standards mit Deuterium-markiertem Isotop enthielt, präzipitiert. 25OHD wurde schließlich mit Hexan extrahiert, gründlich gevortext und dann 10 Minuten lang bei 4 ° C und 3148 × g zentrifugiert. Die obere Hexanphase wurde dann in Glasfläschchen überführt und 25 Minuten lang unter Stickstoff bei 40 °C getrocknet. Der getrocknete Rückstand wurde in 150 μL Methanol/Wasser (70:30) rekonstituiert und auf das LC-MS/MS-System geladen. Die chromatographische Trennung mittels LC-MS/MS wurde unter Verwendung einer Phenomenex Kinetex PFP-Analysesäule (100 × 3,0 mm, 2,6 μm; Phenomenex Inc. Torrance, CA, USA) mit Methanol als mobiler Phase A und 0,1 % Ameisensäure in Wasser als mobiler Phase durchgeführt Phase B. Der isokratische Gradient war wie folgt: 0–2,0 min, 70 % A; 2,0–5,0 Min., 70–75 % A; 5,0–6,5 Min., 75 % A; 6,5–10,0 Min., 75–80 % A; 10,0–11,0 Min., 80 % A; 11,01–12,0 Min., 90 % A; und 12,01–13,0 min, 70 % A. Die Flussrate betrug 0,5 ml/min. Der Säulenofen wurde während der gesamten Analyse auf 45 °C gehalten. Das deuterierte Analogon von 25OHD3 wurde als interner Standard für 3-epi 25OHD3 und 25OHD3 verwendet und das deuterierte Analogon von 25OHD2 wurde als interner Standard für 25OHD2 verwendet. Die MS/MS-Detektion wurde im positiven Elektrospray-Ionisationsmodus durchgeführt. Es wurde der Betriebsmodus „Multiple Reaction Monitoring“ (MRM) verwendet und die MRM-Übergänge für jeden Analyten waren wie folgt: m/z 413,3 → 395,3 (25OHD2), 401,4 → 383,4 (25OHD3), 416,3 → 398,3 (25OHD2 interner Standard, [ 2H]3-25OHD2) und 404,4 → 386,4 (25OHD3 interner Standard, [2H]3-25OHD3). Kalibrierungskurven wurden erstellt, indem das Verhältnis der Chromatographie-Peakflächen für 25OHD2 und 25OHD3 und ihre jeweiligen internen Standards gegen die bekannten Konzentrationen aufgetragen und anschließend eine lineare Regression durchgeführt wurde, um die Daten anzupassen. Die Quantifizierungsgrenzen (LOQs) für 25OHD2 und 25OHD3 betrugen 1,8 bzw. 1,2 ng/ml. Der spezifische Gehalt an 3-epi 25OHD3 wurde unter Verwendung der Kalibrierung von 25OHD3 und [2H]3-25OHD3 als interne Standards quantifiziert. Ein repräsentativer Chromatograph ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Der Linearitätsbereich für 25OHD3 und 25OHD2 betrug 2,5–200 ng/ml und beide Kalibrierungskurven ergaben einen Korrelationskoeffizienten von mehr als 0,999. Die Genauigkeit wurde durch Analyse des SRM 972a des National Institute of Standards and Technology (NIST) validiert. Im Vergleich zu den Referenzwerten von SRM 972a betrug die Genauigkeit von LC-MS/MS für Messungen von 25OHD2, 25OHD3 und 3-epi 25OHD3 104,5 %–106,8 %, 99,5 %–105,9 % bzw. 108,0 %–109,9 %. Die Wiederherstellung wurde geschätzt, indem Serumproben mit zwei Konzentrationen von 25OHD2 und 25OHD3 versetzt und in dreifacher Ausfertigung analysiert wurden. Die Wiederfindung wurde als Verhältnis des gemessenen Werts zur Standardmenge berechnet, die zum Aufstocken der Probe verwendet wurde. Die durchschnittlichen Wiederfindungen für 25OHD2 und 25OHD3 lagen alle bei nahezu 100 %. Die Präzision wurde durch die Analyse dreier Qualitätskontrollproben von Bio-Rad (LiquichekTM Specialty Immunoassay Control, LOT: 57440) bewertet. Die gesamten Variationskoeffizienten (CVs) für 25OHD2 und 25OHD3 betrugen 4,34 % (2,88 %–7,01 %) bzw. 2,82 % (2,45 %–3,21 %).

Immunoassay-Methoden wurden auf den Plattformen Roche, Siemens, DiaSorin, Abbott und IDS durchgeführt, darunter Roche Elecsys Vitamin D Total (Charge: 171102, Gebrauchsanweisungsversion (IFU): 06268668001V1, 02/2011), Siemens ADVIA Centaur Vitamin D Total ( Chargen: 39566029, 10631021; IFU-Version: 10699313, 08/2012), DiaSorin Liaison XL Total Vitamin D (Charge: 131192E; IFU-Version: zh310600 43005, 09/2014), Abbott Architect 25-OHD Vitamin D (Charge: 02614E000; IFU-Version:49-8941/R02,05/2012) bzw. IDS-iSYS (Lot:1996; IFU-Version: IS-2700SPL V02,05/2014).

Die Daten wurden mittels Passing-Bablok-Regression und Bland-Altman-Diagrammen analysiert, um Vergleiche zwischen Methoden auszuwerten. Der gepaarte T-Test wurde verwendet, um die 25OHD-Ergebnisse zwischen den Methoden zu vergleichen. Der Grenzwert für einen Vitamin-D-Mangel lag bei 20 ng/ml1,18. Die Übereinstimmung zwischen den Methoden wurde anhand der Interrater-Übereinstimmung (Kappa-Werte)9 bewertet. Kappa-Koeffizienten wurden berechnet, um den Grad der Übereinstimmung zwischen verschiedenen Methoden zur Identifizierung klinisch relevanter Hypovitaminose (20 ng/ml) zu bewerten. Kappa-Werte über 0,6 deuteten auf eine Übereinstimmung hin, während Werte über 0,8 eine ausgezeichnete Übereinstimmung anzeigten9. Die Genauigkeit wurde als Prozentsatz der Personen mit 25OHD ausgedrückt, gemessen durch Immunoassay innerhalb von 15 % (P15) oder 30 % (P30) von 25OHD, gemessen durch LC-MS/MS. Die P15- und P30-Werte für die fünf Immunoassays wurden mit dem McNemar-Test miteinander verglichen. Statistische Analysen wurden mit Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corporation, USA) und MedCalc Statistical Software (Version 13.3.3, Broekstraat, Mariakerke, Belgien) durchgeführt.

Während alle Immunoassays 25OHD2 nachweisten, variierten die Effizienzen. Nur DiaSorin erreichte eine Nachweiseffizienz von 100 % für den Nachweis von 25OHD3 (Tabelle 1). Die meisten Immunoassays zeigten weniger als 3 % Kreuzreaktivität mit 3-epi 25OHD3; Allerdings war das Roche-System bei der Trennung von 3-epi-25OHD3 von 25OHD3 weniger effizient und wies eine Kreuzreaktivität von 91 % auf. Interessanterweise hatte das Roche-System einen relativ engen analytischen Messbereich (3–70 ng/ml). Im Gegensatz dazu hatten die Roche- und DiaSorin-Systeme eine relativ bessere Präzision als die anderen Plattformen, wobei sowohl CVs als auch Inter-CVs weniger als 5 % betrugen.

Von den Gesamtproben war der Mittelwert ± SD 25OHD wie folgt (Abb. 1): 25,5 ± 12,0 ng/ml (LC-MS/MS), 24,6 ± 12,7 ng/ml (Abbott), 21,7 ± 11,1 ng/ml ( DiaSorin), 25,4 ± 9,9 ng/ml (IDS), 23,9 ± 12,5 ng/ml (Roche) und 39,5 ± 19,8 ng/ml (Siemens). Der gepaarte t-Test zeigte, dass das Ergebnis des Siemens-Systems deutlich höher war als das LC-MS/MS-Ergebnis (P < 0,05), während die Ergebnisse der DiaSorin-, Roche- und Abbott-Immunoassays niedriger waren als die LC-MS/MS-Ergebnisse ( Gepaarte T-Tests, P < 0,05). Die von P15 und P30 geschätzte Genauigkeit zeigte, dass sich die Systeme von Abbott, DiaSorin, IDS und Roche nicht signifikant voneinander unterschieden (P15: 43,67 %, 49,70 %, 45,18 % bzw. 48,80 %, McNemar-Test, p > 0,05). ; P30: 76,20 %, 81,93 %, 76,81 % bzw. 75,60 %, McNemar-Test, p > 0,05), aber ihre Genauigkeitswerte waren deutlich höher als die des Siemens-Systems (P15: 14,76 %; P30: 27,11 %, McNemar-Test). Test, p < 0,01).

Box-and-Whisker-Diagramm, das die Verteilung der Ergebnisse für alle getesteten Tests in insgesamt 332 Serumproben zeigt.

Die mittleren Kästchen repräsentieren den Bereich vom 25. bis 75. Perzentil. Die Linien innerhalb der Kästchen zeigen den Medianwert und das 95 %-KI für den Medianwert für jede getestete Methode. Die Whisker reichen vom minimalen bis zum maximalen Wert, Ausreißer ausgeschlossen. Ein Ausreißerwert ist definiert als ein Wert, der das obere oder untere Quartil plus oder minus das 1,5-fache des Interquartilbereichs überschreitet.

Die meisten Immunoassays (außer Siemens) zeigten eine akzeptable diagnostische Übereinstimmung mit LC-MS/MS (Kappa > 0,6), während Roche den besten Kappa-Wert aufwies (Tabelle 2). Wenn kein 25OHD2 oder 3-epi 25OHD3 nachweisbar war, stimmten alle Immunoassays mit Ausnahme von Siemens hervorragend überein. Bei der getrennten Analyse von Männern und Frauen ergaben die Ergebnisse des 25OHD-Immunoassays einen ähnlichen Trend wie in der Gesamtprobe (Ergänzungstabelle 1).

Darüber hinaus verwendeten wir unter Berücksichtigung der Unterschiede zwischen den Methoden Regressionsmodelle (berechnet aus der Gesamtzahl der Proben), um die Grenzwerte für Immunoassay-Methoden zu übertragen. Nach der Übertragung lagen die Grenzwerte für die Definition von Hypovitaminose D bei 20 (Abbott), 17 (DiaSorin), 21 (IDS), 19 (Roche) bzw. 31 ng/ml (Siemens). Unter Verwendung dieser übertragenen Cut-offs zeigte Siemens die größte Verbesserung des Kappa-Werts (Anstieg von 0,410 auf 0,637) und die meisten Immunoassays zeigten eine akzeptable und verbesserte Übereinstimmung mit LC-MS/MS (Tabelle 2).

Obwohl das DiaSorin-System 25OHD mit 100 % Effizienz und Spezifität für 25OHD3 nachweisen sollte, nahm der Korrelationskoeffizient ab, die Abweichung nahm zu und der Kappa-Wert sank deutlich, wenn die Proben 25OHD2 oder 3-epi 25OHD3 enthielten (Abb. 2). Die anderen vier Immunoassays zeigten einen ähnlichen Trend (Tabelle 2). Der 25OHD2-Spiegel korrelierte signifikant mit der Abweichung zwischen Immunoassay-Methoden (für Abbott, DiaSorin, IDS, Roche und Siemens: r = 0,848, 0,909, 0,834, 0,849 bzw. 0,282) und LC-MS/MS (ergänzende Abbildung 2). Und es zeigte sich, dass, wenn kein 25OHD2 vorhanden war, der Bias-Prozentsatz auf der medizinischen Entscheidungsebene von Roche am geringsten war. Wenn jedoch 25OHD2 vorhanden war, stieg der Bias-Prozentsatz auf der medizinischen Entscheidungsebene deutlich an (Ergänzungstabelle 2).

Vergleich von DiaSorin und LC-MS/MS.

A–E sind Passing-Bablok-Regressionsanalysen für 166 Serumproben, die nur 25OHD3 enthielten, 111 Serumproben, die sowohl 25OHD3 als auch 25OHD2 enthielten, 31 Serumproben, die 25OHD3 enthielten, bzw. alle 332 Serumproben. F–J sind Bland-Altman-Diagramme, die die Abweichung zwischen DiaSorin und LC-MS/MS für 166 Serumproben zeigen, die nur 25OHD3 enthalten; 111 Serumproben, die sowohl 25OHD3 als auch 25OHD2 enthielten; 31 Serumproben mit 25OHD3; 24 Proben mit 25OHD3, 25OHD2 und 3-epi 25OHD3; bzw. alle 332 Serumproben.

Um zu klären, ob die Vakuum-Blutentnahmeröhrchen die Genauigkeit von Immunoassays beeinträchtigen, analysierten wir anschließend 10 Proben nach der Blutentnahme sowohl in VACUETTE 4-ml-Röhrchen ohne Zusatzstoffe als auch in VACUETTE 4-ml-Röhrchen mit Gel und Gerinnungsaktivator und analysierten alle Proben mit dem fünf Immunoassays und LC-MS/MS. Die Ergebnisse sind in Abb. 3 dargestellt und es wurde gezeigt, dass Proben, die in VACUETTE 4-ml-Röhrchen mit Gel und Gerinnungsaktivator gesammelt wurden, offensichtlich höhere Werte aufwiesen als Proben in Röhrchen ohne Zusatzstoffe (mittlere Abweichung (SD): 12,7 (4,3) ng/ml). , P < 0,01) unter Verwendung des Siemens-Systems. Weitere 67 Freiwillige wurden rekrutiert und ihr Serum wurde in VACUETTE 4-ml-Röhrchen ohne Zusatzstoffe gesammelt. Die insgesamt 77 Proben, die in VACUETTE 4-ml-Röhrchen ohne Zusatzstoffe gesammelt wurden, wurden alle sowohl mit dem Siemens-System als auch mit LC-MS/MS analysiert Der Korrelationskoeffizient zwischen den beiden Methoden verbesserte sich, der Bias verringerte sich deutlich und mit einer Steigung nahe 1 wurde eine Übereinstimmung angezeigt (Kappa = 0,68) (Abb. 4).

Eine Abweichung zwischen 25OHD führt bei jeder Methode zu VACUETTE 4-ml-Röhrchen mit Gel und Gerinnungsaktivator und zu VACUETTE 4-ml-Röhrchen ohne Zusatzstoffe.

X-Achse: Probennummern; Y-Achse: 25OHD ergibt VACUETTE 4-ml-Röhrchen mit Gel und Gerinnungsaktivator minus 25OHD ergibt VACUETTE 4-ml-Röhrchen ohne Zusatzstoffe.

Vergleich der 25OHD-Ergebnisse für Siemens und LC-MS/MS in VACUETTE 4-ml-Röhrchen mit Gel und Gerinnungsaktivator und VACUETTE 4-ml-Röhrchen ohne Zusatzstoffe.

A und B sind Passing-Bablok-Regressions- und Bland-Altman-Diagramme von 332 25OHD-Proben, analysiert mit Siemens und LC-MS/MS für Blut, das in VACUETTE 4-ml-Röhrchen mit Gel und Gerinnungsaktivator gesammelt wurde; C und D sind Passing-Bablok-Regressions- und Bland-Altman-Diagramme von 77 25OHD-Proben, die mit Siemens und LC-MS/MS für Blut analysiert wurden, das in VACUETTE 4-ml-Röhrchen ohne Zusatzstoffe gesammelt wurde.

In dieser Studie untersuchten wir Unterschiede in der Genauigkeit von fünf verschiedenen Immunoassay-Systemen zur Analyse von Vitamin D und Vitamin-D-Analoga in Blutproben von 332 Personen. Unsere Daten zeigten, dass die meisten Systeme, mit Ausnahme des Siemens-Systems, eine gute Akzeptanz und Genauigkeit aufwiesen. Darüber hinaus wirkte sich beim Siemens-System die Verwendung bestimmter Blutentnahmeröhrchen erheblich auf die Ergebnisse aus, und wir haben die Auswirkungen von 25OHD-Analoga und VACCUTTE-Röhrchen auf Immunoassays in der Ergänzungstabelle 3 zusammengefasst. Diese Daten haben Auswirkungen auf die weitere Entwicklung und Anwendung von Assays zur Messung Vitamin-D-Spiegel.

In den letzten Jahren haben verschiedene Organisationen Vitamin-D-Standardisierungsstudien durchgeführt, beispielsweise das Vitamin D Standardization-Certification Program (CDC VDSCP) des US Centers for Disease Control and Prevention, das internationale Vitamin D External Quality Assessment Scheme (DEQAS) und das Vitamin D Standardisierungsprogramm (VDSP), das 2010 vom Office of Dietary Supplements der National Institutes of Health (NIH), den US Centers for Disease Control and Prevention, dem US National Institute of Standards and Technology (NIST) und dem Belgium Laboratory for Analytical Chemistry (Gent, Belgien)19,20. Diese Organisationen haben auch die Verbesserung von Vitamin-D-Produkten gefördert, um einen effizienten Nachweis von 25OHD2 und 25OHD3 sowie 3-epi 25OHD3 zu erreichen. Nach unserem besten Wissen haben sich jedoch nur wenige Studien auf die Auswirkungen von 25OHD2 und 3-epi 25OHD3 auf Immunoassay-Methoden konzentriert. Daher war unsere aktuelle Studie die erste, die die Auswirkungen von 25OHD2 und 3-epi 25OHD3 auf die Präzision und Genauigkeit verschiedener Immunoassays verglich.

In den letzten Jahren haben Forscher verschiedene Methoden zum Nachweis von 25OHD verglichen; Obwohl in einigen Studien hohe Korrelationen zwischen den Methoden festgestellt wurden, war es nicht möglich, konsistent die beste Methode zu bestimmen. Farrell et al.8 berichteten, dass alle getesteten Immunoassay-Methoden stark mit LC-MS/MS korrelierten, mit einem Regressionskoeffizienten über 0,9, aber das Roche-System ergab den schlechtesten Korrelationskoeffizienten (r = 0,679); Tatsächlich konnte der in der vorherigen Studie verwendete Assay nur 25OHD3 nachweisen. Mit Schwerpunkt auf Vitamin D2 hat Roche jedoch seine Produkte zum Nachweis von 25OHD2 und 25OHD3 verbessert und wir haben den verbesserten Assay in unserem Experiment verwendet. In einem früheren Bericht21 wurde gezeigt, dass Siemens, DiaSorin und Roche ähnliche und akzeptable Korrelationen mit LC-MS/MS erzeugen, während Koivula et al.22 berichteten, dass die Systeme Abbott, DiaSorin, IDS und Siemens schlechte Regressionskoeffizienten lieferten und nur Siemens und IDS-Systeme zeigten eine gute klinische Übereinstimmung mit LC-MS/MS. Allerdings zeigten Ajuria-Morentin et al.9, dass das Siemens-System im Vergleich zu den anderen Immunoassay-Methoden die schlechteste Korrelation und den größten Bias erzeugte, was mit unseren Ergebnissen übereinstimmt.

Erhebliche Unterschiede zwischen Immunoassay-Methoden können teilweise auf ihre unterschiedlichen Kapazitäten für die Messung von 25OHD2 und 3-epi 25OHD3 zurückzuführen sein. Obwohl alle Hersteller behaupteten, dass ihre Immunoassay-Methoden 25OHD2 nachweisen könnten, wobei DiaSorin behauptete, dass ihr Antikörper die gleiche molare Effizienz für 25OHD2 und 25OHD3 aufwies, sanken alle Regressionskoeffizienten, wenn Proben 25OHD2 enthielten, und die Abweichung zwischen Immunoassay-Methoden und LC-MS/MS korrelierte deutlich mit dem Niveau von 25OHD2. Derzeit werden in China und den USA sowohl Vitamin-D2- als auch Vitamin-D3-Ergänzungsmittel verwendet, was für die Diagnose eines Vitamin-D-Mangels problematisch ist, da unsere Ergebnisse darauf hinweisen, dass die Konsistenz der 25OHD2-Messung durch gängige Immunoassays möglicherweise nicht zufriedenstellend ist. Diese Ergebnisse standen im Widerspruch zu den Ergebnissen einer Studie von Le Goff et al., die zeigten, dass nur die Systeme von Abbott und Siemens eine unbefriedigende Reaktivität mit 25OHD223 zeigten. Während darüber hinaus alle Hersteller (außer Roche) behaupteten, dass ihre Tests nur eine geringe Kreuzreaktivität mit 3-epi 25OHD3 aufwiesen, zeigten unsere Ergebnisse, dass bei allen getesteten Immunoassays die Korrelation mit LC-MS/MS deutlich abnahm, wenn Proben 3-epi 25OHD3 enthielten . Der Gehalt an 3-epi 25OHD3 in unseren Proben war im Vergleich zum gesamten 25OHD relativ niedrig. Einerseits könnte dies die Annahme stützen, dass 3-epi 25OHD3 voraussichtlich keine routinemäßigen Auswirkungen auf LC-MS/MS-Methoden hat, die 3-epi 25OHD3 nicht von 25OHD324 unterscheiden und trennen können. Andererseits hatte es angesichts der geringen Konzentrationen von 3-epi 25OHD3 in den Proben einen relativ signifikanten Einfluss auf die Ergebnisse des Immunoassays. Daher stellen die geringen Konzentrationen und die Seltenheit von 3-epi 25OHD3 in den Proben unserer Studie eine wichtige Einschränkung unserer Arbeit dar. Zukünftige Studien sollten die Auswirkungen erhöhter Konzentrationen von 3-epi 25OHD3 in Proben untersuchen.

Frühere Studien haben gezeigt, dass es für Labore notwendig ist, standortspezifische Referenzintervalle und Protokolle zu entwickeln, um konsistente Ergebnisse zu erzielen9. Darüber hinaus stützen unsere Ergebnisse den Vorschlag, dass standortspezifische Referenzintervalle erforderlich sind, um die Einheitlichkeit zu verbessern; Der Grad der Verbesserung war jedoch plattformabhängig. Beispielsweise verbesserten sich die Siemens-Systeme stärker als die anderen Methoden, wenn die Cut-Off-Werte gemäß der Regressionsgleichung übertragen wurden.

Der Grenzwert für Vitamin-D-Mangel ist ein kontroverses Thema25. IOM empfiehlt, dass 12 ng/ml den notwendigen Bedarf für normale Erwachsene decken können26. Im Gegensatz dazu überprüften Endokrinologen viele Studien zu Vitamin D und kamen zu dem Schluss, dass 20 ng/ml ein besserer Grenzwert für die Definition eines Vitamin-D-Mangels sei18. Unseren Ergebnissen zufolge könnte die Kontroverse durch die unterschiedlichen Immunoassay-Methoden, die in verschiedenen Studien verwendet werden, verschärft werden. Zukünftig wird es notwendig sein, einen Vitamin-D-Mangel anhand von Arbeiten zu definieren, die eine Referenzmethode wie LC-MS/MS verwenden. Angesichts der großen Verzerrung von Siemens, die in der aktuellen Studie und von anderen festgestellt wurde9, ist jedoch zu erwarten, dass dieses spezielle Siemens-System in Gegenwart von Vitamin-D-Analoga unterschiedliche Ergebnisse liefert und empfindlich auf den verwendeten Grenzwert reagiert. Siemens hatte im Oktober 2014 das erste Hormonstandardisierungsprogramm für Vitamin D bestanden, das vom US-amerikanischen CDC organisiert wurde. Das Standardisierungsprogramm erlaubt eine mittlere Abweichung von 5 % als Akzeptanzkriterium und Siemens Healthcare Diagnostics ist zusammen mit IDS die einzige zertifizierte Immunoassay-Methode. Daher sind die Ergebnisse unserer Studie und der Studie von Ajuria-Morentin et al.9 in diesem Zusammenhang etwas verwirrend. Obwohl Borai berichtete, dass BD-Serumtrennröhrchen keinen Einfluss auf die Abbott- und DiaSorin-Immunoassays bei der Messung von 25OHD327 hatten, waren die Auswirkungen von VACUETTE-Blutentnahmeröhrchen auf den Siemens-Immunoassay unklar. In unserer Analyse haben wir festgestellt, dass die Verwendung eines VACUETTE-Röhrchens mit Gel und Gerinnungsaktivator, das in unserem Krankenhaus häufig zur Messung von 25OHD verwendet wird, zu deutlich höheren Messwerten führte als Proben, die in Röhrchen ohne Zusatz mit dem Siemens-System gesammelt wurden. Wichtig ist jedoch, dass LC-MS/MS aufgrund des verwendeten Röhrchentyps keinen signifikanten Bias erzeugte. 25OHD-Ergebnisse für Blutproben, die in VACUETTE-Röhrchen ohne Zusatzstoffe entnommen wurden, zeigten im Vergleich zu LC-MS/MS eine hervorragende Leistung. Die Gründe für diese Beobachtungen sind nicht geklärt. Es ist möglich, dass der Gerinnungsaktivator, das Trenngel oder einige andere Elemente im VACUETTE 4-ml-Röhrchen mit Gel und Gerinnungsaktivator die unspezifische Kreuzreaktivität zwischen magnetpartikelmarkierten Antikörpern und Acridiniumester verstärkten, was zu erhöhten Chemilumineszenzwerten führte. Diese Möglichkeiten können nicht vollständig geklärt werden, da die Röhrenhersteller und Siemens über die spezifische Zusammensetzung ihrer Produkte Stillschweigen wahren. Obwohl die spezifischen Auswirkungen insbesondere beim Siemens-System nicht bekannt sind, wird es daher wichtig sein, zu bestimmen, welche Blutentnahmeröhrchen für eine zuverlässige Verwendung geeignet sind. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, die Auswirkungen der Blutentnahmeröhrchen bei der Auswahl von 25OHD-Immunoassays zu bewerten. Weitere Studien sind erforderlich, um die Mechanismen zu klären, durch die das Blutentnahmeröhrchen die Messung von 25OHD mit dem Siemens-System stört.

Zusammenfassend zeigten unsere Ergebnisse, dass die meisten automatisierten Immunoassays eine akzeptable Korrelation und Übereinstimmung mit LC-MS/MS aufwiesen, wenn kein nachweisbares 25OHD2 oder 3-epi 25OHD3 vorhanden war. Allerdings hatte das Vorhandensein von entweder 25OHD2 oder 3-epi 25OHD3 erhebliche Auswirkungen auf die Ergebnisse von Immunoassay-Methoden. Daher sollten bei der Festlegung des Grenzwerts für einen Vitamin-D-Mangel die Unterschiede zwischen den Methoden berücksichtigt werden. Darüber hinaus ist es beim Einsatz des Siemens-Systems unerlässlich, geeignete Vakuum-Blutentnahmeröhrchen zur Messung von 25OHD in klinischen Laboren oder für epidemiologische Untersuchungen zu verwenden.

Zitierweise für diesen Artikel: Yu, S. et al. 25OHD-Analoga und Vakuum-Blutentnahmeröhrchen beeinträchtigen die Genauigkeit automatisierter Immunoassays erheblich. Wissenschaft. Rep. 5, 14636; doi: 10.1038/srep14636 (2015).

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Die Autoren danken den Herstellern, darunter Siemens, IDS, DiaSorin, Roche und Abbott, für ihre Unterstützung bei der Bereitstellung von Reagenzien und technischer Hilfe. Diese Arbeit wurde vom China National Clinical Key Subject Program und dem National High Technology Research and Development Program of China (863 Program, 2014AA022304) sowie der National Natural Science Foundation of China (81201337, 81171665) finanziert. Die Fördergeber waren weder an der Durchführung dieser Arbeit noch an den durchgeführten Analysen beteiligt und waren auch nicht an der Entscheidung zur Veröffentlichung beteiligt.

Yu Songlin, Cheng Xinqi und Fang Huiling haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Abteilung für klinisches Labor, Peking Union Medical College Hospital, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften, Peking, 100730, China

Songlin Yu, Xinqi Cheng, Huiling Fang, Jianhua Han, Xuzhen Qin, Qian Cheng, Wei Su, Li'an Hou, Liangyu Xia und Ling Qiu

Abteilung für klinisches Labor, China-Japan-Krankenhaus, Peking, 100029, China

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QL hat die Forschung entworfen; YS und FH trugen zur Erfassung, Analyse und Interpretation von Daten sowie zum Verfassen der Arbeit bei; CX, ZR, HJ, QX, HL, SW, XL und CQ führten die Forschung durch, rekrutierten die Probanden, analysierten die Proben und sammelten die Daten. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yu, S., Cheng, X., Fang, H. et al. 25OHD-Analoga und Vakuum-Blutentnahmeröhrchen beeinträchtigen die Genauigkeit automatisierter Immunoassays erheblich. Sci Rep 5, 14636 (2015). https://doi.org/10.1038/srep14636

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Eingegangen: 2. Juni 2015

Angenommen: 2. September 2015

Veröffentlicht: 30. September 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep14636

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