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Apr 20, 2023

Beta2

npj Parkinson-Krankheit

npj Parkinson's Disease Band 8, Artikelnummer: 61 (2022) Diesen Artikel zitieren

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β2-Adrenorezeptor (β2AR)-Agonisten wurden mit einem verringerten Risiko für die Entwicklung der Parkinson-Krankheit (PD) in Verbindung gebracht und es wird angenommen, dass sie die Expression sowohl von Alpha-Synuclein-mRNA (Snca) als auch von Protein (α-syn) verringern. Die Auswirkungen des β2AR-Agonisten Clenbuterol auf die Spiegel von Snca-mRNA und α-syn-Protein wurden in vivo (Ratten und Mäuse) und in primären kortikalen Neuronen von Ratten von zwei unabhängigen Labors untersucht. Eine leichte Abnahme der Snca-mRNA in der Substantia nigra wurde nach einer einzelnen akuten Dosis Clenbuterol bei Ratten beobachtet, diese Abnahme hielt jedoch nach mehreren Dosen nicht an. Im Gegensatz dazu blieben die α-syn-Proteinspiegel sowohl bei Einzel- als auch bei Mehrfachdosierungsparadigmen unverändert. Darüber hinaus verringerte Clenbuterol weder Snca in kultivierten primären kortikalen Neuronen von Ratten noch Snca oder α-syn bei Mäusen. Darüber hinaus führte die wiederholte Gabe im Vergleich zum Einzeldosis-Paradigma bei Nagetieren zu wesentlich niedrigeren Clenbuterolspiegeln im Plasma und Gehirngewebe. Basierend auf unseren Beobachtungen einer vorübergehenden Abnahme von Snca und keiner Auswirkung auf das α-syn-Protein in dieser präklinischen Studie stützen diese Daten die Schlussfolgerung, dass Clenbuterol wahrscheinlich keine praktikable krankheitsmodifizierende Strategie für Parkinson ist.

Die Bildung und Ansammlung intrazellulärer Lewy-Körperchen (LBs) ist ein zentrales pathologisches Merkmal der Parkinson-Krankheit (PD). Ein Hauptbestandteil von LBs ist das Protein Alpha-Synuclein (α-syn), insbesondere α-syn, das an Serin 129 (pSyn)1,2,3,4,5 fehlgefaltet, aggregiert und phosphoryliert ist. Eine Aggregation von α-syn kommt bei idiopathischen und den meisten familiären Formen der Parkinson-Krankheit vor. Mutationen im Gen, das für α-syn kodiert (im Folgenden als SNCA bezeichnet, wenn es um Menschen geht, und als Snca, wenn es um Nagetiere geht) sowie SNCA-Duplikation und -Triplikation können die Neigung von α-syn zur Aggregation erhöhen6,7,8,9. Die Vervielfältigung oder Verdreifachung von SNCA führt zu einem Effekt der Gendosis, wobei die Verdreifachung im Vergleich zur Verdoppelung zu einem früheren Auftreten der Symptome und einem schnelleren Fortschreiten der Krankheit führt10.

Obwohl α-syn häufig als pathologische Ursache diskutiert wird, die mit dem Krankheitszustand verbundene Aggregate bildet, ist die monomere lösliche Form ein entscheidender Bestandteil der neuronalen Funktion. Es wurde vermutet, dass α-syn neben anderen vorhergesagten Funktionen auch beim Transport und der Neurotransmission synaptischer Vesikel, der Mitochondrienfunktion, der Dopaminbiosynthese und -verarbeitung, der Chaperonproteinfunktion, der DNA-Reparatur und der Genexpression eine Rolle spielt11,12,13,14,15,16, 17,18,19,20. Unzureichende α-syn-Spiegel können möglicherweise schädlich für Neuronen und die neuronale Funktion sein, weshalb ein vollständiger Abbau oder die Eliminierung von α-syn wahrscheinlich unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen würde21,22. Tatsächlich haben transgene Mausmodelle gezeigt, dass das Ausschalten von Snca allein nicht ausreicht, um Effekte hervorzurufen23,24, und dass ein gleichzeitiges Ausschalten von Snca, Sncb und Sncg erforderlich ist, um starke Defizite hervorzurufen25,26,27. Diese transgenen Modelle unterliegen dem Vorbehalt erheblicher Kompensationsmechanismen, die mit dem Fehlen von Snca von Geburt an verbunden sind, wobei in Snca-/--Mäusen bis zu 369 unterschiedlich exprimierte Gene gemeldet wurden28.

Kumulative Daten deuten darauf hin, dass moderate Reduktionen von α-syn das beste Potenzial als therapeutische Strategie haben, d. h. die Senkung der α-syn-Spiegel bei gleichzeitiger Beibehaltung des kritischen Schwellenwerts, der erforderlich ist, um potenzielle Funktionsverlusteffekte in Neuronen zu vermeiden. Dennoch ist die Modulation der α-syn-Spiegel im Gehirn nicht trivial. Tiermodelle, bei denen die Genexpression über shRNA oder Antisense-Nukleotide verändert wurde, hatten gemischte Ergebnisse, wobei einige Studien Toxizität zeigten29,30, andere dagegen nicht31,32,33,34. Alternativ könnten pharmazeutische Interventionen einen besseren Ansatz darstellen, um eine geringfügige, aber physiologisch bedeutsame Verringerung von α-syn zu bewirken.

Es wurde berichtet, dass Medikamente, die auf den β2-Adrenorezeptor (β2AR) abzielen, die α-syn-Spiegel modulieren und das Parkinson-Risiko beeinflussen35,36,37,38,39,40. Populationsbasierte Studien haben einen Zusammenhang zwischen der Verwendung von β2AR-Agonisten und einem verringerten Parkinson-Risiko berichtet37,38, obwohl andere diese Ergebnisse in Frage gestellt haben und festgestellt haben, dass β2AR-Agonisten allein keinen Einfluss auf das Parkinson-Risiko haben39,40. Abgesehen von den inkonsistenten Ergebnissen dieser Assoziationsstudien deuten präklinische Beweise bei Nagetieren und Zellkulturen darauf hin, dass Medikamente, die auf β2AR wirken, die α-syn-Expression beeinflussen können37. Insbesondere wird berichtet, dass β2AR-Agonisten die Snca-mRNA und das α-syn-Protein in vivo und in vitro verringern37. Umgekehrt wurde berichtet, dass β2AR-Antagonisten die Snca-mRNA und das α-syn-Protein in Kultur erhöhen37. Es wird angenommen, dass die Veränderung der α-syn-Spiegel über β2AR durch Transkriptionsregulation durch Acetylierung oder Deacetylierung von H3K27 entlang der Snca-Promotor- und Enhancer-Stellen erfolgt; mit β2AR-Agonisten oder β2AR-Antagonisten, die zu einer Abnahme bzw. Zunahme des permissiven acetylierten H3K27 führen und somit die Transkription von Snca37 beeinträchtigen. Darüber hinaus wurde berichtet, dass der β2AR-Agonist Clenbuterol in Modellen, die Merkmale der Parkinson-Krankheit rekapitulieren, von Vorteil ist. Insbesondere verringert Clenbuterol die SNCA-mRNA und das α-syn-Protein in menschlichen iPSCs mit SNCA-Verdreifachung und verhindert die Neurodegeneration im 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP)-Mausmodell von PD37.

Die vorliegende Reihe von Experimenten ist der Höhepunkt der Arbeit, die unabhängig voneinander in Laboren der Michigan State University (MSU) und von Biogen durchgeführt wurde. In diesen Experimenten versuchten wir, die ursprünglichen Erkenntnisse zu reproduzieren und darauf aufzubauen, dass β2AR-Agonisten, insbesondere Clenbuterol, Snca-mRNA und α-syn-Protein in Nagetieren und Zellkulturen reduzieren37. Allerdings führte das bei Ratten verwendete Clenbuterol-Dosierungsparadigma weder zu einer Verringerung des α-syn-Proteins in Akutstudien noch zu Veränderungen des Snca- oder des α-syn-Proteins nach mehreren Dosen. Direkte Replikationsstudien an Mäusen spiegelten die bei Ratten beobachteten Ergebnisse wider, wobei nach Einzel- oder Mehrfachdosen von Clenbuterol keine signifikante Verringerung des Snca- oder α-Syn-Proteins beobachtet wurde. Darüber hinaus gab es keine Veränderung bei Snca in primären kortikalen Kulturen von Ratten. Zusammengefasst deuten die Ergebnisse darauf hin, dass etwaige Verringerungen des α-syn-Transkripts nach Clenbuterol vorübergehender Natur sind und nicht zu einer verringerten Häufigkeit des α-syn-Proteins führen. Daher kommen wir zu dem Schluss, dass Clenbuterol wahrscheinlich nicht zu einer wirksamen krankheitsmodifizierenden PD-Behandlung führen wird.

Wir haben zunächst bestätigt, dass nigrostriatale Dopaminneuronen von Ratten β2AR exprimieren, indem wir In-situ-Hybridisierung (Adrb2) in Kombination mit Immunhistochemie (IHC) für Tyrosinhydroxylase (TH) in der Substantia nigra (SN) verwendeten. In einzelnen TH-immunreaktiven (THir) Nigralneuronen wurden zahlreiche Adrb2-mRNA-Punkte beobachtet (Abb. 1a).

Ratten erhielten eine einzelne intraperitoneale Injektion von 10, 20 oder 40 mg/kg Clenbuterol (Clen) oder Kochsalzlösung (Veh), und 24 Stunden nach der Injektion wurde Gewebe entnommen. ein repräsentatives Bild der In-situ-Hybridisierung für Adrb2-mRNA, die für β2AR kodiert, kolokalisiert in immunreaktiven Tyrosinhydroxylase (TH)-Neuronen im SNpc einer unbehandelten Ratte. b Snca auf Gapdh normalisiert und über ddPCR gemessen. c Leicht lösliche α-syn-Fraktion, isoliert aus dem SN. d Zunächst unlösliche α-Syn-Fraktion, isoliert aus dem SN, solubilisiert mit einem stärkeren Lysepuffer. e Leicht lösliche α-syn-Fraktion, isoliert aus dem Striatum. f Zunächst unlösliche α-syn-Fraktion, isoliert aus dem Striatum, solubilisiert mit einem stärkeren Lysepuffer. Alle Proteinfraktionen wurden mittels Western Blot gemessen und als Prozentsatz der Kontrolle grafisch dargestellt. Repräsentative Blots sind unter dem jeweiligen Diagramm dargestellt. Spalten geben die Gruppenmittelwerte an, Kreise stellen einzelne Datenpunkte dar (n = 10 pro Gruppe vor Entfernung der Ausreißer), Fehlerbalken stellen ±1 Standardfehler des Mittelwerts dar. Ein Sternchen steht für Signifikanz (p ≤ 0,05). Ausreißer wurden basierend auf der absoluten Abweichung von der Medianmethode entfernt. In b wurde eine Probe aus den Fahrzeug-, 10- und 40-mg/kg-Gruppen und zwei Proben aus der 20-mg/kg-Gruppe entnommen. Es wurden keine weiteren Ausreißer entfernt.

Basierend auf intraperitonealen (ip) Injektionen, die im Vergleich zu subkutanen Injektionen (ergänzende Abbildung 1) zu deutlich höheren Clenbuterolspiegeln im Liquor führten (ergänzende Abbildung 1), wurde die ip-Verabreichung ausgewählt. Um frühere Studien37 widerzuspiegeln, verabreichten wir eine einzelne Injektion (ip) von 10, 20 oder 40 mg/kg Clenbuterol oder Vehikel (Kochsalzlösung), Snca-mRNA und α-syn-Protein wurden im SN und α-syn-Protein im untersucht Striatum 24 Stunden später (siehe Versuchsaufbau, ergänzende Abbildung 2). Bei Ratten, die eine einzelne Injektion von 10 oder 20 mg/kg Clenbuterol erhielten, wurde mithilfe der digitalen Tröpfchen-PCR (ddPCR) eine geringfügige, aber signifikante Abnahme von Snca im SN beobachtet (Abb. 1b). Snca wurde sowohl durch die 10 mg/kg- als auch die 20 mg/kg-Dosis um etwa 20 % reduziert, wohingegen bei Ratten, die die höchste Dosis, 40 mg/kg, erhielten, keine signifikante Verringerung des Snca beobachtet wurde (Abb. 1b).

Die Vorbereitung von Nigral- und Striatalproben der Ratte zur Messung des α-syn-Proteins erfolgte mithilfe einer zweistufigen Lyse. Im ersten Schritt wurden ein schwacher Lysepuffer und eine Stößelhomogenisierung verwendet, um die zuvor berichteten Proteinisolierungsverfahren zu replizieren37, die als „lösliches α-syn“ bezeichnet werden. Im zweiten Schritt wurden ein starker RIPA-Puffer (Radio-Immunpräzipitationsassay) und eine Ultraschallbehandlung des aus dem ersten Schritt verbleibenden Pellets verwendet, das als „unlösliches α-Syn“ bezeichnet wird. Wir haben bei Verwendung einer Clenbuterol-Dosis keine Auswirkungen einzelner ip-Clenbuterol-Injektionen bei Ratten auf die löslichen oder unlöslichen α-Syn-Proteinspiegel im SN beobachtet (Abb. 1c, d). In ähnlicher Weise zeigten Western Blots für das leicht lösliche und unlösliche α-Syn im Striatum keine Veränderung bei der Verabreichung von Clenbuterol (Abb. 1e, f).

Die fehlende Abnahme des α-syn-Proteins, die nach einmaliger Verabreichung von Clenbuterol beobachtet wurde, könnte im Gegensatz zur beobachteten Abnahme des Transkripts auf einen unzureichenden Proteinabbau/-clearance über das 24-Stunden-Intervall zurückzuführen sein. Dies deutet darauf hin, dass bei ausreichender Zeit eine Verringerung des α-syn-Proteins zu beobachten ist. Um die Auswirkung der Clenbuterol-Verabreichung über ein längeres Mehrfachdosierungsparadigma zu bestimmen, untersuchten wir die Snca-mRNA- und α-syn-Proteinspiegel mit einer Woche wiederholter Clenbuterol-Verabreichung (ergänzende Abbildung 3). Ratten erhielten alle 48 Stunden eine ip-Injektion für insgesamt vier Dosen, basierend auf der berichteten 30-Stunden-Halbwertszeit von Clenbuterol im Plasma bei oraler Verabreichung41. Ratten in Clenbuterol-Gruppen zeigten im Vergleich zu den Kontrollen bei allen drei Dosen am 2., 4., 6. und 7. Tag der Injektionsserie einen deutlichen Gewichtsverlust (ergänzende Abbildung 4). Bei der Untersuchung der Snca-mRNA beobachteten wir im Gegensatz zu den Ergebnissen des Einzelinjektionsparadigmas bei keiner Dosis im SNca-Paradigma eine Veränderung des Snca im SN (Abb. 2a). Western Blots für lösliches und unlösliches α-Syn im SN und im Striatum zeigten ebenfalls keine Veränderung der Reaktion auf eine Clenbuterol-Dosis (Abb. 2b – e).

Ratten erhielten alle 48 Stunden intraperitoneale Injektionen von 10, 20 oder 40 mg/kg Clenbuterol (Clen) oder Kochsalzlösung (Veh). Am 7. Tag, 24 Stunden nach der letzten Injektion, wurde Gewebe entnommen. Vor jeder Injektion wurden die Ratten gewogen, um das für die Dosis erforderliche Arzneimittel- oder Vehikelvolumen zu berechnen. ein Snca, normalisiert auf Gapdh und gemessen über ddPCR. b Leicht lösliche α-syn-Fraktion, isoliert aus dem SN. c Zunächst unlösliche α-Syn-Fraktion, isoliert aus dem SN, solubilisiert mit einem stärkeren Lysepuffer. d Leicht lösliche α-syn-Fraktion, isoliert aus dem Striatum. e Zunächst unlösliche α-syn-Fraktion, isoliert aus dem Striatum, solubilisiert mit einem stärkeren Lysepuffer. Alle Proteinfraktionen wurden mittels Western Blot gemessen und als Prozentsatz der Kontrolle grafisch dargestellt. Repräsentative Blots sind unter dem jeweiligen Diagramm dargestellt. Spalten geben die Gruppenmittelwerte an, Kreise stellen einzelne Datenpunkte dar (n = 10 pro Gruppe vor Entfernung der Ausreißer), Fehlerbalken stellen ±1 Standardfehler des Mittelwerts dar. Ein Sternchen steht für Signifikanz (p ≤ 0,05). Ausreißer wurden basierend auf der absoluten Abweichung von der Medianmethode entfernt. In einem Fall wurden zwei Proben aus der 20-mg/kg-Gruppe und eine Probe aus der 40-mg/kg-Gruppe entnommen. In b wurden zwei Proben aus der 40 mg/kg-Gruppe entnommen. In c und e wurde eine Probe aus der 40 mg/kg-Gruppe entnommen. Es wurden keine weiteren Ausreißer entfernt.

Mittal et al.37 haben zuvor die Auswirkungen von Clenbuterol auf die α-syn-Expression bei Mäusen untersucht. In ihrer Studie erhielten Mäuse entweder eine einzelne ip-Injektion von Clenbuterol (10 mg/kg), gelöst in Kochsalzlösung, oder ein gleiches Volumen Kochsalzlösung als Kontrolle. Die Tiere wurden 24 Stunden nach der Injektion verarbeitet und im SN37 wurde über einen Rückgang sowohl der Snca-mRNA als auch des α-syn-Proteins um 20–50 % berichtet. Um herauszufinden, ob Clenbuterol-Effekte spezifisch für Mäuse sind, führten wir eine Studie mit Parametern durch, die mit den zuvor berichteten identisch waren (ergänzende Abbildung 2)37.

Im SN tendierte die Snca-mRNA bei mit Clenbuterol behandelten Tieren zu einem Rückgang, der Effekt war jedoch nicht signifikant (Abb. 3a). Ergebnisse einer bei Biogen durchgeführten Replikatstudie unter Verwendung des gleichen Einzeldosis-Paradigmas und Zeitpunkts zeigten ebenfalls keine Veränderung der Snca-mRNA (Abb. 3b). Die Beurteilung des α-syn-Proteins mittels Western Blot erfolgte erneut unter Verwendung einer zweistufigen Lyse. Sowohl in löslichen als auch in unlöslichen Fraktionen beobachteten wir keine Abnahme des α-syn-Proteins im SN (Abb. 3c, d). Im Striatum gab es in der Clenbuterol-Gruppe einen signifikanten, wenn auch leichten Anstieg des löslichen α-syn, der 109,1 % ± 2,41 der Kontrolle betrug (Abb. 3e). Es gab jedoch keinen nachweisbaren Anstieg von unlöslichem α-syn in der mit Clenbuterol behandelten Gruppe (Abb. 3f).

Mäuse erhielten eine einzelne intraperitoneale Injektion von 10 mg/kg Clenbuterol (Clen) oder Kochsalzlösung (Veh) und Gewebe wurde 24 Stunden nach der Injektion gesammelt. ein Snca, normalisiert auf Gapdh und gemessen über ddPCR. b Ergebnisse aus dem Biogen-Labor, Snca-mRNA normalisiert auf Rpl13a-mRNA und gemessen über RT-qPCR. c Leicht lösliche α-syn-Fraktion, isoliert aus dem SN. d Zunächst unlösliche α-Syn-Fraktion, isoliert aus dem SN, solubilisiert mit einem stärkeren Lysepuffer. e Leicht lösliche α-syn-Fraktion, isoliert aus dem Striatum. f Zunächst unlösliche α-syn-Fraktion, isoliert aus dem Striatum, solubilisiert mit einem stärkeren Lysepuffer. Alle Proteinfraktionen wurden mittels Western Blot gemessen und als Prozentsatz der Kontrolle grafisch dargestellt. Repräsentative Blots sind unter dem jeweiligen Diagramm dargestellt. Spalten geben die Gruppenmittelwerte an, Kreise stellen einzelne Datenpunkte dar (n = 10 pro Gruppe vor Entfernung der Ausreißer), Fehlerbalken stellen ±1 Standardfehler des Mittelwerts dar. Ein Sternchen steht für Signifikanz (p ≤ 0,05). Ausreißer wurden basierend auf der absoluten Abweichung von der Medianmethode entfernt. In einem Fall wurden zwei Proben aus dem Fahrzeug und eine Probe aus den Clen-Gruppen entnommen. Es wurden keine weiteren Ausreißer entfernt.

Unter Berücksichtigung der Möglichkeit, dass sich die Wirkung von Clenbuterol verzögern könnte, untersuchten wir die Auswirkungen mehrerer Injektionen von 10 mg/kg Clenbuterol bei Mäusen über eine Woche (ergänzende Abbildung 3). Es gab keine Veränderung der Snca-mRNA im SN nach einem einwöchigen Behandlungsparadigma (Abb. 4a). In ähnlicher Weise beobachteten wir im Western Blot weder in der löslichen noch in der unlöslichen Fraktion einen Einfluss mehrfacher Injektionen auf das α-syn-Protein im Maus-SN (Abb. 4b, c). Ebenso gab es nach einer Woche keine Veränderung der unlöslichen oder unlöslichen α-syn-Fraktionen im Striatum (Abb. 4d, e). Im Vergleich zum Vehikel verloren Mäuse, die Clenbuterol erhielten, zu Beginn dieses Dosierungsparadigmas an Gewicht, erholten sich jedoch und zeigten am vierten Tag der Injektionen und darüber hinaus keinen signifikanten Gewichtsverlust (ergänzende Abbildung 4).

Mäuse erhielten alle 48 Stunden intraperitoneale Injektionen von 10 mg/kg Clenbuterol (Clen) oder Kochsalzlösung (Veh). Am 7. Tag, 24 Stunden nach der letzten Injektion, wurde Gewebe entnommen. ein Snca, normalisiert auf Gapdh und gemessen über ddPCR. b Leicht lösliche α-syn-Fraktion, isoliert aus dem SN. c Zunächst unlösliche α-Syn-Fraktion, isoliert aus dem SN, solubilisiert mit einem stärkeren Lysepuffer. d Leicht lösliche α-syn-Fraktion, isoliert aus dem Striatum. e Zunächst unlösliche α-syn-Fraktion, isoliert aus dem Striatum, solubilisiert mit einem stärkeren Lysepuffer. Alle Proteinfraktionen wurden mittels Western Blot gemessen und als Prozentsatz der Kontrolle grafisch dargestellt. Repräsentative Blots sind unter dem jeweiligen Diagramm dargestellt. Spalten geben die Gruppenmittelwerte an, Kreise stellen einzelne Datenpunkte dar (n = 10 pro Gruppe vor Entfernung der Ausreißer), Fehlerbalken stellen ±1 Standardfehler des Mittelwerts dar. Ein Sternchen steht für Signifikanz (p ≤ 0,05). Ausreißer wurden basierend auf der absoluten Abweichung von der Medianmethode entfernt. In einem Fall wurde eine Probe aus den Veh- und Clen-Gruppen entnommen. Es wurden keine weiteren Ausreißer entfernt.

Da im ursprünglichen Bericht37 eine Abnahme des α-syn-Proteins durch einen enzymgebundenen Immunoassay (ELISA) nachgewiesen wurde, analysierten wir auch Mauskohorten mithilfe eines kommerziell erhältlichen ELISA. Wir beobachteten nach 24 Stunden bei den akut behandelten Mäusen keinen Einfluss von Clenbuterol auf die löslichen oder unlöslichen α-Syn-Proteinspiegel im SN oder im Striatum (Abb. 5a, c, e, g). Im einwöchigen Paradigma gab es keine Änderung der löslichen oder unlöslichen α-Syn-Proteinspiegel im SN und keine Änderung der löslichen α-Syn-Proteinspiegel im Striatum (Abb. 5b, d, f). Wir beobachteten einen signifikanten Anstieg des α-syn-Proteins im Striatum in der unlöslichen Fraktion, 34,9 ± 1,9 pg/µg in der einwöchigen Clenbuterol-Gruppe im Vergleich zu 27,9 ± 1,6 pg/µg in der Vehikel-Kontrollgruppe (Abb. 5h). . Die ELISAs und ein Teil der Western Blots im Originalbericht verwendeten einen anderen α-syn-Antikörper (Millipore, MABN1817, α-syn-Klon 2F12) als wir (Abcam, ab212184). Leider hatten wir vom SN kein Lysat übrig, um eine zweite Bewertung der α-syn-Spiegel mit diesem anderen Antikörper durchzuführen. Um diesen Unterschied auszuräumen, haben wir jedoch die lösliche Fraktion aus dem Striatum weiter untersucht. Auch hier gab es durch Western Blot keine Veränderung der stratumlöslichen Fraktion im 24-Stunden- oder 1-Wochen-Paradigma unter Verwendung des MABN1817-Antikörpers (ergänzende Abbildung 5).

Ein im Handel erhältliches ELISA-Kit wurde verwendet, um α-syn im Plasma und den verbleibenden Proteinlysaten aus den 1-Tag- und 1-Wochen-Dosierungsparadigmen der Maus mit 10 mg/kg zu messen. Leicht lösliches α-syn, das nach einem Tag und b nach einer Woche aus dem SN isoliert wurde. Zunächst unlösliches α-Syn, isoliert aus SN, solubilisiert mit einem stärkeren Lysepuffer bei c 1 Tag und d 1 Woche. Lösliches α-syn aus dem Striatum bei e 1 Tag und f 1 Woche. Unlösliches α-syn aus dem Striatum bei g 1 Tag und h 1 Woche. Gesamtes α-syn im Plasma nach 1 Tag und 1 Woche. Spalten geben die Gruppenmittelwerte an, Kreise stellen einzelne Datenpunkte dar (n = 10 pro Gruppe vor Entfernung der Ausreißer), Fehlerbalken stellen ±1 Standardfehler des Mittelwerts dar. Ein Sternchen steht für Signifikanz (p ≤ 0,05). Ausreißer wurden basierend auf der absoluten Abweichung von der Medianmethode entfernt. In einem Fall wurden keine Ausreißer entfernt, die geringe Probengröße in der Fahrzeuggruppe war auf die begrenzte Menge an Protein zurückzuführen, die für den Test übrig blieb. In b wurde eine Probe aus den Veh- und Clen-Gruppen entfernt. In i, j wurde eine Probe aus der Fahrzeuggruppe entfernt. Es wurden keine weiteren Ausreißer entfernt.

Ein verbleibender Unterschied zwischen unserer Probenvorbereitung und der von Mittal et al.37 bestand darin, dass alle Ratten und Mäuse in unseren Studien mit Kochsalzlösung perfundiert wurden, um das Potenzial des α-syn-Proteins im Blut zu eliminieren, das zu den α-syn-Spiegeln im Gehirngewebe beitragen würde . Um festzustellen, ob Clenbuterol den α-syn-Proteinspiegel im Blut beeinflusst, haben wir das α-syn-Protein im Plasma gemessen. Wir beobachteten weder im 24-Stunden- noch im 1-Wochen-Paradigma nach der Injektion von 10 mg/kg Clenbuterol Unterschiede in den Plasma-α-syn-Proteinspiegeln bei Mäusen (Abb. 5i, j).

Insgesamt beobachteten wir sowohl bei Ratten als auch bei Mäusen, dass die Fähigkeit von Clenbuterol, α-syn zu reduzieren, auf eine Verringerung des α-syn-Transkripts nach einer einzigen Injektion beschränkt war, was im Paradigma der Mehrfachinjektion nicht mehr zu beobachten war. β2AR unterliegt bei chronischer Agonistenexposition einer Desensibilisierung42. Auf die Desensibilisierung von β2AR kann die Internalisierung und/oder Herunterregulierung des Rezeptors folgen. Um mögliche Veränderungen von β2AR zu untersuchen, wurde Gewebe aus Striatum und Hippocampus zunächst in einem starken Lysepuffer homogenisiert und per Western Blot bewertet. Das gesamte β2AR-Protein blieb nach einer Woche Clenbuterol-Behandlung im Striatum und im Hippocampus unverändert (ergänzende Abbildung 6a, b). Ein Marker für internalisiertes β2AR ist die Phosphorylierung der Serine 355/356 durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase43. Phosphoryliertes β2AR (ser355/356) blieb nach einer Woche Clenbuterol-Behandlung sowohl im Striatum als auch im Hippocampus unverändert (ergänzende Abbildung 6c, d). Zusammengenommen unterstützen diese Ergebnisse nicht, dass es bei wiederholter Clenbuterol-Verabreichung zu einer Internalisierung oder Herunterregulierung des β2AR-Rezeptors kam. Diese Ergebnisse können jedoch eine funktionelle Desensibilisierung nicht ausschließen, bei der die Agonistenbindung eine schwächere Reaktion hervorruft.

Ein zusätzlicher Endpunkt, den wir untersuchten, waren die Proteinspiegel des Dopamintransporters (DAT), der für die Aufnahme von MPP+, dem toxischen Metaboliten von MPTP44,45, erforderlich ist. Bisher nicht im Zusammenhang mit der Verwendung von Clenbuterol gemessen, könnte eine durch Clenbuterol vermittelte Abnahme des DAT möglicherweise die neuroprotektiven Wirkungen erklären, die für Clenbuterol im MPTP-Mausmodell berichtet wurden37. Im Striatum von Mäusen reduzierte eine einzelne Injektion von 10 mg/kg Clenbuterol die DAT-Proteinspiegel im Vergleich zur Kontrolle signifikant um ~23 % (ergänzende Abbildung 7a). Diese Verringerung des striatalen DAT wurde im Mehrfachinjektionsparadigma nicht beobachtet (ergänzende Abbildung 7b). Darüber hinaus blieb das striatale DAT-Protein bei Ratten nach einer einzelnen Clenbuterol-Injektion oder nach mehreren Injektionen unverändert (ergänzende Abbildung 7c, d).

Clenbuterol im Plasma und Gehirn (Hippocampus) wurde gemessen, um die Konzentrationen sowohl bei Ratten als auch bei Mäusen zu bestimmen. Sowohl beim Einzel- als auch beim Mehrfachinjektionsparadigma bei Ratten wurde ein dosisabhängiger Anstieg der gebundenen und ungebundenen Clenbuterolspiegel in Plasma und Gewebe beobachtet (Abb. 6a, c, e). Bemerkenswerterweise waren die Clenbuterolspiegel, die bei Tieren gemessen wurden, die mehrere Injektionen erhielten, deutlich niedriger als bei ihren Gegenstücken mit einer einzigen Injektion (Abb. 6a, c, e). Die Clenbuterolspiegel in der gebundenen Fraktion der Einzelinjektionsgruppen waren etwa 7-, 14- und 32-mal höher als bei den jeweiligen Mehrfachinjektionsgruppen mit 10, 20 und 40 mg/kg. Der Clenbuterolspiegel in der ungebundenen Fraktion der Einzelinjektionsgruppen war etwa 4-, 10- bzw. 10-mal höher als bei den jeweiligen Gegenstücken mit 10, 20 und 40 mg/kg Mehrfachinjektion. Der Gesamt-Clenbuterolspiegel im Plasma der Einzelinjektionsgruppen war etwa 4-, 3- und 10-mal höher als bei den jeweiligen Gegenstücken mit 10, 20 und 40 mg/kg Mehrfachinjektion. Während der dosisabhängige Anstieg der Clenbuterol-Spiegel in Plasma und Gewebe zu erwarten war, war dies bei den verringerten Spiegeln nach einer Reihe von Injektionen im Vergleich zu einer einzelnen Injektion nicht der Fall. Ebenso war bei Mäusen Clenbuterol im Plasma und Gewebe nach mehreren Injektionen niedriger als nach einer einzelnen Injektion (Abb. 6b, d, f). In der Gruppe mit Einzelinjektion waren die Clenbuterolspiegel in der gebundenen und ungebundenen Fraktion etwa 7 bzw. im Plasma dreimal höher als in der Gruppe mit Mehrfachinjektion. Angesichts der Tatsache, dass sowohl die Einzel- als auch die Mehrfachinjektionsgruppe etwa 24 Stunden nach ihrer letzten Injektion getötet wurden, wäre zu erwarten, dass die Clenbuterolspiegel in der Mehrfachinjektionsgruppe aufgrund der Akkumulation entweder vergleichbar oder höher wären.

Es wurden Gewebe aus dem Hippocampus und Plasma von Mäusen und Ratten im 1-Tages- und 1-Wochen-Paradigma gesammelt. Das Gewebe wurde behandelt, um das Clenbuterol (Clen) abzutrennen, das mit Proteinen interagierte und nicht, wodurch eine gebundene bzw. ungebundene Clenbuterol-Fraktion entstand. Gebundenes Clenbuterol bei a-Ratten und b-Mäusen. Ungebundenes Clenbuterol bei C-Ratten und D-Mäusen. Gesamt-Clenbuterol im Plasma von E-Ratten und F-Mäusen. Spalten geben die Gruppenmittelwerte an, Kreise stellen einzelne Datenpunkte dar (n = 5 pro Gruppe), Fehlerbalken stellen ±1 Standardfehler des Mittelwerts dar. Eine Linie, die die Spalten verbindet, zeigt die Signifikanz zwischen Gruppen an (p ≤ 0,05).

Ähnlich wie bei Mittal et al.37 wurden primäre kortikale Neuronen von Ratten aus E18 Sprague-Dawley-Rattenembryonen zwei Tage lang mit Clenbuterol (1, 5, 10 oder 20 µM) behandelt und dann mittels RT-qPCR auf Snca-mRNA untersucht. Im Gegensatz zum vorherigen Bericht37 hatte Clenbuterol in keiner Konzentration einen Einfluss auf das α-Syn-Transkript (Abb. 7a). Der entsprechende Zelllebensfähigkeitstest zeigte keine signifikante Toxizität im Zusammenhang mit irgendeiner der verwendeten Konzentrationen von Clenbuterol. (Abb. 7b).

Primäre kortikale E18-Neuronen der Ratte wurden mit Clenbuterol oder Vehikel behandelt. a Snca, gemessen über RT-qPCR in Neuronen, die bei DIV11 exponiert und 2 Tage später geerntet wurden. b Zelllebensfähigkeit primärer Neuronen, die bei DIV11 exponiert und 2 Tage später untersucht wurden. Spalten geben die Gruppenmittelwerte an, Kreise stellen einzelne Datenpunkte aus demselben Experiment dar, Fehlerbalken stellen ±1 Standardfehler des Mittelwerts dar. Ein Sternchen steht für Signifikanz (p ≤ 0,05).

Der Einsatz von β2AR-Agonisten und -Antagonisten im Hinblick auf Parkinson und das Parkinson-Risiko war Gegenstand von Debatten. Zunächst wurde gezeigt, dass β2AR-Agonisten das Parkinson-Risiko in einer norwegischen Bevölkerung senken37. Bei der Untersuchung in einer USA-Kohorte und angepasst an das Rauchen hatte die Verwendung von β2AR-Agonisten keinen Einfluss auf das Parkinson-Risiko39. Eine separate Kohorte aus Israel hat ebenfalls über den Einsatz von β2AR-Agonisten zur Verringerung des Parkinson-Risikos berichtet, selbst wenn Rauchen, Alkoholkonsum, Wohnort und andere Variablen in die Analyse einbezogen wurden38. Kürzlich wurde berichtet, dass β2AR-Agonisten das Parkinson-Risiko bei Nicht-Diabetikern senken und gleichzeitig das Risiko bei Patienten mit Diabetes erhöhen40. In Bezug auf β2AR-Antagonisten und Parkinson gibt es Berichte, die auf einen Zusammenhang mit einem erhöhten Risiko hinweisen37,38, solche, die keinen Zusammenhang zeigen46, und solche, die einen Zusammenhang bis zur Anpassung an eine anhaltende Exposition beobachteten, eine 5-jährige Verzögerung zwischen Exposition und Parkinson-Diagnose. oder ein spezifischer Antagonist Propranolol35,36,39,40. Der mit einem erhöhten PD-Risiko verbundene Einsatz von Propranolol geht mit dem Vorbehalt einher, dass es zur Behandlung von essentiellem Tremor eingesetzt wird, der wiederum mit einem erhöhten PD-Risiko verbunden ist38,39,40,47. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass kontrollierte Laborstudien, da es keinen eindeutigen Konsens in Bezug auf die Bevölkerungsassoziationsdaten gibt, von entscheidender Bedeutung sind, um wichtige Erkenntnisse zur Bestimmung des Potenzials von β2AR-Agonisten für die PD-Behandlung zu liefern.

In präklinischen Studien wurde gezeigt, dass Clenbuterol bei Mäusen und Zellkulturstudien die α-syn-Expression durch Histonmodifikationen verringert, was nach einer einzigen Verabreichung zu einer Verringerung der Snca-mRNA und des α-syn-Proteins führt37. In der vorliegenden Studie konnten wir die Beobachtungen von Mittal et al.37 teilweise wiederholen. Insbesondere beobachteten wir eine signifikante Verringerung der Snca-mRNA oder einen Trend zu einer Verringerung, jedoch konnten wir bei keiner der Arten eine Verringerung des α-syn-Proteins nach einer einzigen Injektion von Clenbuterol an Ratten oder Mäuse feststellen. Um die Auswirkungen der wiederholten Verabreichung von Clenbuterol auf Snca-mRNA und α-syn-Protein zu verstehen, die zuvor von Mittal et al.37 nicht untersucht wurden, haben wir die Auswirkungen auch in einem Mehrfachinjektionsparadigma untersucht. Die wiederholte Verabreichung von Clenbuterol führt weder bei Mäusen noch bei Ratten zu einer Verringerung des Transkripts oder Proteins. Darüber hinaus hat Clenbuterol ebenfalls keinen Einfluss auf die Snca-mRNA in primären kortikalen Kulturen. Während unsere vorliegenden Ergebnisse die frühere Erkenntnis wiederholen, dass eine einmalige Verabreichung von Clenbuterol die Snca-mRNA reduzieren kann, haben wir durch die Erweiterung unserer Analyse um die Wirkung einer einwöchigen wiederholten Clenbuterol-Verabreichung festgestellt, dass jede Verringerung der Snca-mRNA kurzfristig erscheint. Wichtig ist, dass bei keinem der Clenbuterol-Verabreichungsparadigmen eine Auswirkung auf die Reduzierung des α-syn-Proteins beobachtet wurde.

Es wurde gezeigt, dass die β2AR-Agonisten Salmeterol und Clenbuterol neuroprotektive Eigenschaften gegen MPTP haben37,48. Allerdings ist der Mechanismus, durch den β2AR-Agonisten für diesen Neuroschutz sorgten, unklar und die Ergebnisse sind mit gewissen Einschränkungen verbunden. In beiden Berichten wurde der β2AR-Agonist vor und während der MPTP-Injektionen verabreicht37,48 was die Möglichkeit einer direkten Arzneimittelwirkung mit MPTP ermöglichte, den Metabolismus von MPTP durch MAO-B in seinen toxischen Metaboliten MPP+ verringerte und die Aufnahme von MPP+ in Neuronen verringerte über DAT oder Reduzierung der Neuroinflammation. In unserer vorliegenden Studie beobachteten wir, dass die akute Verabreichung von Clenbuterol bei Mäusen mit einer geringfügigen Verringerung der DAT verbunden war. Dies erhöht die Möglichkeit, dass die durch Clenbuterol vermittelte Verringerung der DAT-Spiegel und/oder -Funktion die MPP+-Aufnahme beeinträchtigte, wodurch die anfängliche MPTP-Toxizität verringert und eine pseudoneuroprotektive Wirkung erzeugt wurde.

Obwohl MPTP eine selektive Degeneration des nigrostriatalen Signalwegs hervorruft, führt es nicht zu einer robusten α-syn-Pathologie49,50. Das Fehlen pathologischer α-Syn-Einschlüsse in diesem Modell legt nahe, dass die Clenbuterol-vermittelte Abnahme des pathologischen α-Syn wahrscheinlich nicht der Mechanismus der Neuroprotektion ist, über den im MPTP-Modell berichtet wird37. Es wird darauf hingewiesen, dass transgene α-syn-Nullmäuse gegen akute und chronische MPTP-induzierte Toxizität resistent sind51, was möglicherweise einen Verlust von α-syn bei der Neuroprotektion im MPTP-Modell impliziert. Eine Resistenz gegen den Mitochondrienkomplex-I-Inhibitor Rotenon wird jedoch in α-syn-null-embryonalen Mittelhirnneuronen nicht beobachtet51. Diese etwas widersprüchlichen Ergebnisse lassen darauf schließen, dass kompensatorische Genveränderungen, die mit dem Verlust von α-syn während der Entwicklung verbunden sind, an der Neuroprotektion vor MPTP in α-syn-Nullmäusen und nicht am Verlust von α-syn an sich beteiligt sein könnten.

Man kann vernünftigerweise davon ausgehen, dass eine chronische Verabreichung von β2AR-Agonisten erforderlich wäre, um eine wirksame Modifizierung der Parkinson-Krankheit zu erreichen. In der vorliegenden Studie wurde eine signifikante Verringerung der Snca-mRNA bei Ratten nur im Paradigma der einzelnen Clenbuterol-Injektion beobachtet. Darüber hinaus wurde bei der höchsten Dosis bei Ratten (40 mg/kg) keine Veränderung der mRNA beobachtet, was auf eine umgekehrt U-förmige Dosis-Wirkungs-Kurve bei akutem Clenbuterol schließen lässt. Nach mehreren Injektionen über eine Woche hinweg wurde kein Rückgang der Snca-mRNA festgestellt, was auf eine mit Clenbuterol verbundene Tachyphylaxie schließen lässt. Der Rückgang des Clenbuterolspiegels nach wiederholter Verabreichung macht es schwierig zu bestimmen, ob ein anhaltender β2AR-Agonismus das α-syn-Protein reduzieren könnte. Es ist möglich, dass ein anderer β2AR-Agonist, der keiner Tachyphylaxie unterliegt, α-syn verringern könnte. Wie oben erwähnt, kann eine längere Stimulation von β2AR zu einer Desensibilisierung, Internalisierung und Herunterregulierung des Rezeptors führen. Es hat sich gezeigt, dass Clenbuterol-Dosen von nur 0,5 mg/kg zweimal täglich über 4–7 Tage zu einer funktionellen Desensibilisierung kortikaler β2ARs führen52. So niedrige Dosen wie 0,3 mg/kg zweimal täglich über 14 Tage und 0,25 mg/kg einmal täglich über 10 Tage führten zu einer Rezeptordesensibilisierung in der Aorta bzw. im Uterus der Ratte53,54. Obwohl wir in der vorliegenden Studie keinen Rückgang der β2AR-Phosphorylierung oder ihrer Häufigkeit beobachten konnten, ist es weiterhin möglich, dass es nach wiederholter Clenbuterol-Verabreichung zu einer funktionellen β2AR-Desensibilisierung kommt. Dies liefert eine mögliche Erklärung dafür, warum die Einzeldosis mit einer verringerten α-syn-mRNA verbunden war, nicht jedoch das Paradigma der wiederholten Dosierung. Eine weitere Möglichkeit für die unterschiedlichen Auswirkungen auf die α-syn-mRNA, die bei Einzel- oder Mehrfachdosierungsparadigmen beobachtet werden, besteht darin, dass die wiederholte Verabreichung von Clenbuterol den eigenen Stoffwechsel beschleunigt. Tatsächlich beobachteten wir sowohl im Gehirn als auch im Plasma niedrigere Clenbuterolspiegel nach dem Mehrfachinjektionsparadigma im Vergleich zur Einzelinjektion. Clenbuterol ist ein Substrat der Cytochrom-P450-Enzyme CYP1a1 und CYP1a255, und seine Verabreichung an Hühner erhöht das mikrosomale Cytochrom P45056 in der Leber. Insgesamt wirft die vorübergehende Natur der Snca-mRNA-Reduktion, die beim Einzeldosierungsparadigma beobachtet wird, kombiniert mit keiner nachweisbaren Reduktion des α-syn-Proteins in irgendeinem Paradigma, die durch den β2AR-Agonisten Clenbuterol induziert wird, die Frage auf, ob β2AR-Agonisten irgendwelche langfristigen Vorteile bieten würden eine risikomindernde oder krankheitsmodifizierende Therapie für Parkinson.

Ein weiteres zu berücksichtigendes Konzept sind die wirksamen und toxischen Dosen des β2AR-Agonisten. Es wurde berichtet, dass bei Mäusen 10 mg/kg Clenbuterol erforderlich sind, um α-syn zu verringern, was 24 Stunden nach der Injektion zu ~20 ng/g Clenbuterol im Gehirngewebe führt37. Obwohl Clenbuterol nicht von der FDA für die Anwendung beim Menschen zugelassen ist, wird es häufig als rezeptfreie Ergänzung zur Gewichtsabnahme und zum Muskelwachstum eingenommen. Beim Menschen liegen die eingenommenen Dosen in der Größenordnung von 20–100 Mikrogramm, wobei bei diesen Dosen in einigen Fällen über Nebenwirkungen wie Tachykardie, Brustschmerzen, Herzklopfen, Zittern und Myokardischämie berichtet wurde57,58,59,60. In Nagetiermodellen kann chronisches Clenbuterol das Myokardgewebe schädigen61,62. Diese möglichen unerwünschten Nebenwirkungen, die mit relativ niedrigen Dosen einhergehen, können das therapeutische Potenzial von Clenbuterol einschränken. Ähnliche Vorsicht wäre bei der Verwendung anderer langwirksamer β2AR-Agonisten geboten, wenn das Ziel darin bestünde, Gehirnspiegel zu erreichen, die den Berichten zufolge bei Mäusen zur Verringerung von α-syn erforderlich sind.

Unsere vorliegende Studie konzentrierte sich auf die Wirkung von Clenbuterol speziell auf das α-syn-Protein. Wir können jedoch nicht ausschließen, dass β2AR-Agonisten möglicherweise über andere Mechanismen Neuroprotektion und/oder symptomatischen Nutzen bei Parkinson bieten. In Tiermodellen wurde gezeigt, dass β2AR-Agonisten den Transport über das große neutrale Aminosäuresystem erhöhen und so den Transport von L-Tyrosin für die Dopaminsynthese sowie Levodopa durch die Blut-Hirn-Schranke steigern63,64,65,66,67,68. Es wurde berichtet, dass der bei Asthma häufig verwendete β2AR-Agonist Albuterol zu einer Verbesserung einiger motorischer Parkinson-Symptome führt, wenn er als Zusatztherapie zu Levodopa eingesetzt wird63,64. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass β2AR-Agonisten entzündungshemmende Eigenschaften haben, die mit der Neuroprotektion verbunden sind. Reduzierung des ionisierten Calcium-bindenden Adaptermoleküls 1 (IBA1) und des phagozytischen Markerclusters des Differenzierungsmoleküls 68 (CD68) positiver Mikroglia als Reaktion auf Rotenon69, reduzierte induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS) und des Clusters des Differenzierungsmoleküls 11B (CD11b) mRNA-Expression in des Hippocampus als Reaktion auf Kainsäure70, Unterdrückung der Mikroglia-Proliferation71, Reduzierung des Tumornekrosefaktors Alpha (TNF-α) und Interleukin 6 (IL-6) als Reaktion auf Lipopolysaccharide (LPS)72,73, Reduzierung von TNF-α und Stickstoffmonoxid Mikroglia und Neuroprotektion durch LPS wurden alle berichtet48. Es wurde auch gezeigt, dass β2AR-Agonisten neurotrophe Faktoren wie den Nervenwachstumsfaktor und den aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor70,74,75 erhöhen. Zusätzlich zu PD-Modellen wurde berichtet, dass β2AR-Agonisten in präklinischen Modellen für ischämischen Schlaganfall76 und Exzitotoxizität70 neuroprotektiv wirken, die Neurogenese und die dendritische Verzweigung fördern und zerebrale Amyloidplaques im Alzheimer-Modell der transgenen APP/PS1-Maus verringern und motorische Vorteile in der Alzheimer-Krankheit bewirken SOD1G93A transgenes ALS-Mausmodell77.

Zusammenfassend zeigen unsere vorliegenden In-vivo-Ergebnisse bei zwei Arten und In-vitro-Ergebnisse, die in zwei separaten Labors durchgeführt wurden, dass die Fähigkeit von Clenbuterol, α-syn zu reduzieren, vorübergehend ist und sich auf eine geringfügige Abnahme der α-syn-mRNA, nicht jedoch des Proteins, beschränkt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass diese minimalen Wirkungen bei wiederholter Verabreichung verloren gehen, möglicherweise aufgrund einer Desensibilisierung des β2AR-Rezeptors und/oder eines erhöhten Arzneimittelstoffwechsels. Basierend auf diesen Erkenntnissen kommen wir zu dem Schluss, dass der β2AR-Agonist Clenbuterol per se nicht das Potenzial hat, α-syn als krankheitsmodifizierende Strategie für Parkinson zu senken.

Drei Monate alte männliche Fischer 344-Ratten (n = 90) wurden von Charles River Laboratories gekauft; Acht Wochen alte männliche C57BL/6 J-Mäuse (n = 40) wurden vom Jackson Laboratory gekauft. Ratten wurden zu 1–3 pro Käfig und Mäuse zu 5 pro Käfig in einem Raum mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten, und Futter und Wasser wurden nach Belieben bereitgestellt. Alle Tierarbeiten wurden im Vivarium des Michigan State University Grand Rapids Michigan State Research Center durchgeführt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Michigan State University Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) der Michigan State University genehmigt und durchgeführt.

Clenbuterol-HCl-Pulver (Sigma-Aldrich C5423; Lot-Nr. BCBQ2163V) wurde vor der Verwendung bei 4 °C gelagert. Ungefähr 30–60 Minuten vor den Injektionen wurde Clenbuterol in steriler 0,9 %iger Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 5 mg/ml, bezogen auf die freie Base, verdünnt und dann gevortext, bis es vollständig in Lösung war. Die Tiere wurden gewogen und erhielten dann eine intraperitoneale (ip) oder subkutane (sc) Injektion der entsprechenden Lösungsmenge basierend auf dem Gewicht, um 10, 20 oder 40 mg/kg Clenbuterol abzugeben. Die Vehikel-Kontrollgruppen erhielten 0,9 Gew.-% Kochsalzlösung in einer Menge, die der höchsten an die Spezies abgegebenen Menge entsprach: Mäuse (10 mg/kg) oder Ratten (40 mg/kg). In Mehrfachdosisstudien wurden die Injektionen jeden zweiten Tag durchgeführt, wobei die Halbwertszeit von ca. 30 Stunden41 genutzt wurde, um den Clenbuterolspiegel die ganze Zeit über aufrechtzuerhalten. Alle Wägungen und Injektionen wurden am Morgen durchgeführt, wobei die Tiere am Tag nach der letzten Injektion eingeschläfert und Gewebe/Plasma entnommen wurden.

Die Tiere wurden mit einer Überdosis Pentobarbital (Beuthanasia-D Special, Merck Animal Health) (30 mg/kg) eingeschläfert. Um CSF zu sammeln, wurden Ratten in einem stereotaktischen Instrument befestigt, das so modifiziert war, dass es ein Schmetterlings-Kopfhautvenenset enthielt (Exel International, 26708). Die Nadel wurde in die Cisterna magna eingetaucht, der Liquor entnommen und für kurze Zeit auf Eis gelagert. CSF wurde zentrifugiert (10.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C), um Spuren von Blut zu entfernen, und dann bei –80 °C gelagert. Um Plasma zu sammeln, wurde Herzblut mit einer heparinisierten Spritze entnommen, in ein BD Vacutainer™-Blutentnahmeröhrchen (BD 367862) überführt, zum Mischen umgedreht und auf Eis gehalten, bis die Proben verarbeitet werden konnten. Das Blut wurde zentrifugiert (3.000 U/min für 5 Minuten bei 4 °C), das Plasma wurde gesammelt und bei –80 °C gelagert. Unmittelbar nach der Herzblutentnahme wurden Ratten intrakardial und Mäuse transkardial mit eiskalter heparinisierter Kochsalzlösung (0,9 %) perfundiert, um Blut aus dem Gehirn zu entfernen, das die Ergebnisse verkomplizieren könnte. Die Gehirne wurden entnommen und in 2-Methylbutan auf Trockeneis schockgefroren und dann bei –80 °C gelagert. Die Gehirne wurden montiert und auf einem Kryostat bei –15 °C in die interessierenden Regionen geschnitten. Anschließend wurden die interessierenden Regionen (Striatum, Substantia nigra, Hippocampus) mikrodisseziert und in Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt. Für Western Blots, ELISAs und Massenspektrometrie gesammeltes Gewebe wurde auf Trockeneis aufbewahrt und dann bei –80 °C gelagert. Für die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR) gesammeltes Gewebe wurde in DNase/RNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 µL TRIzol-Reagens (Invitrogen 26696026) gegeben, mit einem Einwegstößel homogenisiert, das Volumen des TRIzol-Reagens auf 1 ml gebracht, durch Pipettieren gemischt und eingefroren Trockeneis und bei −80 °C gelagert.

Proben in TRIzol wurden auf Eis aufgetaut und kurz zentrifugiert, um die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln. Phasemaker-Mikrozentrifugenröhrchen (Invitrogen, A33248) wurden durch 30-sekündiges Zentrifugieren bei 16.000 × g hergestellt. Jede Probe wurde in ein Phasemaker-Röhrchen überführt und 5 Minuten lang bei RT inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 200 µL Chloroform. Die Röhrchen wurden von Hand geschüttelt, 10 Minuten bei RT inkubiert und 5 Minuten bei 16.000 × g und 4 ° C zentrifugiert. Die wässrige Phase (klare Flüssigkeit) wurde in ein RNase-freies Röhrchen überführt, ein gleiches Volumen 100 % Ethanol wurde zugegeben und die Proben wurden kurz gevortext. Zur weiteren Verarbeitung der Proben wurde ein säulenbasiertes Nukleinsäure-Reinigungskit (Zymo Research, R1016) mit Methoden verwendet, die gegenüber den Anweisungen des Herstellers modifiziert wurden. Von der Probe wurden jeweils 600 µL auf die Säule gegeben und 1 Minute lang bei 12.000 × g zentrifugiert. Dies wurde wiederholt, bis die gesamte Probe verbraucht war. Alle RNA-Wasch-/Vorbereitungspufferschritte wurden durch Zugabe des Puffers zur Säule und 1-minütiges Zentrifugieren bei 12.000 × g durchgeführt. Nachdem die Proben auf die Säulen geladen wurden, wurden die Proben mit 400 µL RNA-Waschpuffer gewaschen. Ein 1X DNase I-Cocktail (DNase I von Thermo Scientific FEREN0521; Reaktionspuffer mit MgCl2 von Thermo Scientific FERB43) wurde zur Säule gegeben und 15 Minuten bei RT inkubiert. Nachdem der DNase I-Cocktail durch die Säule zentrifugiert worden war, wurden 400 µL RNA-Vorbereitungspuffer hinzugefügt und durch die Säule geleitet. Die Säulen wurden zweimal mit RNA-Waschpuffer gewaschen, jeweils 700 µL und dann 400 µL, und dann 2 Minuten lang bei 12.000 × g getrocknet. DNase/RNase-freies Wasser (15 µl) wurde zugegeben, die Säulen 1 Minute bei RT inkubiert und die RNA durch Zentrifugation (1 Minute bei 10.000 × g) eluiert. Die Qualität und Quantität der RNA wurde mit einem Agilent 2100 Bioanalyzer unter Verwendung eines Agilent RNA 6000 Pico Kit (5067-1513) bewertet. Vor der Lagerung der RNA bei –80 °C wurde die RNA mit DNase/RNase-freiem Wasser auf 1 ng/µL verdünnt und aliquotiert.

Die RNA wurde aufgetaut und 2 ng wurden mit iScript Reverse Transcription Supermix für die cDNA-Synthese (Bio-Rad, 1708841) verwendet. Die cDNA-Synthese wurde in einem Thermocycler mit den folgenden Einstellungen durchgeführt: 5 Min. bei 25 °C, 20 Min. bei 46 °C, 1 Min. bei 95 °C, gehalten bei 4 °C (konstante Deckeltemperatur von 105 °C). Falls eine Lagerung bei –20 °C erforderlich war, wurde die gesamte cDNA mit 2X cDNA-Aufbewahrungspuffer verdünnt (gleiche Teile 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 0,1 mM EDTA, pH (8,0)). Um Proben für die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR) vorzubereiten, wurde die cDNA bei Bedarf auf Eis aufgetaut und ein Mastermix mit 2X ddPCR Supermix for Probes (Bio-Rad, 186-3026) und den 20X Taqman-Primersondensätzen hergestellt. Die für Mäuse verwendeten Sonden waren Snca (Applied Biosystems #4331182, Mm01188700_m1, FAM-MGB); und zwei verschiedene Referenzsonden, Gapdh (Applied Biosystems #4331182, Mm99999915_g1, VIC-MGB) und Rpl13 (Applied Biosystems #4331182, Mm02342646_g1, VIC-MGB). Auf Rpl13 normalisierte Ergebnisse sind in der ergänzenden Abbildung 8 zu finden. Die für Ratten verwendeten Sonden waren Snca (Applied Biosystems #4331182, Rn00569821_m1, FAM-MGB) und die Referenzsonde war Gapdh (Applied Biosystems #4331182, Rn01749022_g1, VIC-MGB). Bei allen verwendeten Taqman-Primersondensätzen erstreckte sich die Sonde über eine Exon-Exon-Verbindung. Zu gleichen Teilen wurden cDNA und Mastermix in Röhrchen gegeben, gemischt, kurz zentrifugiert und 20 µL in die Probenvertiefungen der DG8-Tröpfchengeneratorkartuschen (Bio-Rad, 1864008) gegeben. Zu den Ölquellen in der Kartusche wurden 70 µl Tröpfchen erzeugendes Öl (Bio-Rad, 1863005) gegeben. Eine Gummidichtung (Bio-Rad, 1863009) wurde über der Kartusche befestigt und ein QX-Tröpfchengenerator (Bio-Rad, 186-4002) verwendet, um RNA-haltige Tröpfchen zu erzeugen. Aus der Tröpfchenvertiefung der Kartusche werden 40 µL Tröpfchen auf eine 96-Well-Platte (Bio-Rad, 12001925) übertragen. Nachdem alle Proben übertragen wurden, wurde die Platte mit einer durchstechbaren Folie (Bio-Rad, 181-4040) und einem Plattenversiegeler (Bio-Rad, 181-4000) versiegelt. Die Platten wurden mit den folgenden Einstellungen in einen Thermocycler (Bio-Rad, C1000) überführt: 10 Min. bei 95 °C, 39 Zyklen (30 Sek. bei 94 °C, 1 Min. bei 60 °C), 10 Min. bei 98 °C , bei 12 °C halten (konstante Deckeltemperatur von 105 °C). Nach der PCR werden die Platten auf den QX200-Tröpfchenleser (Bio-Rad, 1864003) übertragen und die Ergebnisse mit der QuantaSoft-Software analysiert. Für alle Proben wurde das interessierende Gen auf das Referenzgen normalisiert. Gapdh wurde als eines der Referenzgene ausgewählt, da es sich um ein herkömmlich verwendetes Haushaltsgen und -protein handelt und in den meisten Geweben eine hohe und konsistente mRNA-Expression aufweist. Ein zusätzliches Referenzgen, Rpl13a, wurde ebenfalls verwendet, da das verwandte Gen Rpl13 in Mittal et al.37 verwendet wurde, das ursprünglich über die Auswirkungen von Clenbuterol auf Snca-mRNA und α-syn-Protein berichtete. Die Verwendung verschiedener Referenzgene zur Normalisierung hatte keinen Einfluss auf die Gesamtergebnisse.

Die Probenvorbereitung zur Untersuchung des α-syn-Proteins erfolgte in zwei Schritten: einer anfänglichen schwachen Lyse wie bei Mittal et al.37 durchgeführt und einem zweiten starken Lyseschritt am verbleibenden Pellet. Aus den –80 °C entnommenen gefrorenen Gewebestanzen wurden 100 µL und 200 µL schwacher Lysepuffer (320 mM Saccharose, 5 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 10 mM Tris (pH 7,4), 1 mM EGTA, 1 mM EDTA) hinzugefügt dem SN bzw. dem Striatum hinzugefügt. Das Gewebe wurde mit einem Einwegstößel homogenisiert, 10 Minuten auf Eis inkubiert und 10 Minuten bei 10.000 × g und 4 ° C zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen überführt und erneut 10 Minuten lang bei 10.000 × g und 4 °C zentrifugiert und der Überstand gesammelt, wobei, wenn überhaupt, nur ein kleines Pellet übrig blieb. RIPA-Lysepuffer (Santa Cruz Biotechnology, sc-24948), der der ursprünglichen Menge an schwachem Lysepuffer entsprach, wurde dem Pellet zugesetzt, das aus der anfänglichen Zentrifugation der schwachen Lysefraktion übrig blieb. Das Pellet im RIPA-Puffer wurde mit 2–4 Stößen eines Sondenschallgeräts (Qsonica Q125), einer Sonde mit 2 mm Durchmesser (QSonica. 4423), 1-s-Impulsen und einer auf 30 % eingestellten Amplitude homogenisiert. Proben in RIPA-Puffer wurden 10 Minuten lang bei 10.000 × g und 4 °C zentrifugiert und der Überstand gesammelt, obwohl nur wenig bis gar kein Pellet vorhanden war. Ein Bicinchoninsäure (BCA)-Assay (Fisher, 23223, Bicinchoninsäure; Fisher, 23224, Kupfersulfat) wurde verwendet, um die Proteinmenge in den schwachen und starken (RIPA) Lysepufferfraktionen vor der Lagerung bei –80 °C abzuschätzen.

Ein dreifacher Probenpuffer wurde hergestellt (140 µl 50 % Glycerin/0,1 Bromphenolblau, 40 µl 10 % SDS und 20 µl Beta-Mercaptoethanol) und zu 5–10 µg Protein jeder Probe hinzugefügt. Die Proben wurden 5 Minuten lang bei 100 °C inkubiert, auf Eis gekühlt, kurz gemischt und zentrifugiert und auf ein 4–20 %iges Criterion TGX 26-Well-Fertiggel (Bio-Rad, 5671095) in Laufpuffer (3,03 % Trizma-Basis, 14,4 % Glycin, 1 % SDS). Es wurde eine Precision Plus Protein Dual Die Gele wurden bei konstanter Spannung betrieben, beginnend bei 90 V für 45 Minuten und dann bei 130 V, bis die Farbstofffront fast vom Gel abgelaufen war. Bevor das Gel fertig war, wurden die Membranen für den Transfer vorbereitet. Für α-Syn-Blots wurden eine 0,45 µm Nitrozellulosemembran (Bio-Rad, 1620167) und Blotpapier (Bio-Rad, 1620118) mindestens 5 Minuten lang in Transferpuffer (3,03 % Trizma-Base, 14,4 % Glycin, 20 % Methanol). Für alle anderen Proteine ​​wurde anstelle der Nitrozellulosemembran eine Immobilon-FL-Membran (Millipore, IPFL00010) 30 s lang in 100 % Methanol aktiviert und dann in Transferpuffer eingeweicht. Ein Nasstransfer wurde 45 Minuten lang bei konstantem Strom, 400 mA, durchgeführt. Unmittelbar nach Abschluss des Transfers wurden die Membranen entfernt und nur im Fall der α-syn-Blots 30 Minuten lang in 0,4 % Paraformaldehyd in 1X tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) (pH 7,4) fixiert. Die Membranen wurden 2 × 5 Minuten mit TBS gewaschen. Die Membranen wurden 5 Minuten lang in Revert Protein Dye (LI-COR 926-11021) inkubiert, 2 × 30 Sekunden mit einer Lösung aus 6,7 % Eisessig und 30 % Methanol gewaschen, mit ddH2O gespült und bei 700 nm auf einem LI abgebildet -COR Odyssey CLx für Gesamtprotein. Die Membranen wurden entfernt, 2 × 5 Minuten mit TBS gewaschen und 1 Stunde lang in 1:1 TBS-Tween (0,1 %):StaringBlock T20-Blockierungspuffer (Thermo Scientific, 37543) blockiert. Die Membranen wurden in primärem Antikörper in 1:1 TBS-Tween (0,1 %):StaringBlock T20-Blockierungspuffer über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die verwendeten Primärantikörper waren: 1:1.000 Kaninchen-Anti-α-syn (Abcam, ab212184, Lot#GR3185934), 1:500 Maus-Anti-α-syn (Millipore, MABN1817, Lot#3099686), 1:500 Ratten-Anti-DAT (Millipore, MAB369, Lot#3258730), 1:1.000 Kaninchen-Anti-DAT (Sigma-Aldrich, D6944, Lot#087M4786V), 1:1.000 Kaninchen-Anti-β2AR (Invitrogen, MA5-32570, Lot#UH2832117), 1: 500 Kaninchen-Anti-β2AR, phosphoryliert an Serin 355 (Invitrogen, PA5-38403, Chargen-Nr. UI2847382), und 1:500 Kaninchen-Anti-β2AR, phosphoryliert an Serin 346 (Invitrogen, PA5-36784, Chargen-Nr. UH2832047). Die Membranen wurden 3 × 5 Minuten mit TBS-Tween (0,1 %) gewaschen und 1 Stunde lang bei RT im Dunkeln in sekundärem Antikörper inkubiert. Verwendete Sekundärantikörper waren: 1:15.000 Esel-Anti-Kaninchen-IRDye 800CW (LI-COR, 926-32213, Lot-Nr. C60322-03), 1:15.000 Ziege-Anti-Maus-IRDye 800CW (LI-COR, 926-32210, Lot-Nr. C20808-02) oder 1:15.000 Ziegen-Anti-Ratten-IRDye 800CW (LI-COR, 926-32219, Lot#C90813-13). Die Membranen wurden im Dunkeln aufbewahrt und 3 × 5 Minuten mit TBS-Tween (0,1 %) und 1 × 5 Minuten in TBS gewaschen und auf einem LI-COR Odyssey CLx für das interessierende Protein abgebildet. Die Bandensitometrie wurde mit LI-COR Image Studio Lite (Version 5.2) durchgeführt. Um die Gesamtproteinfärbung und die entsprechende Zielbande wurden Kästchen eingezeichnet, um das Gesamtproteinsignal und das Zielbandensignal in jeder Spur zu erhalten. Die Signale von jeder Gesamtprotein-Färbungsspur wurden durch das höchste Signal der Gesamtprotein-Färbungsspur dividiert, um den Spurnormalisierungsfaktor für jede Spur zu berechnen. Das normalisierte Signal für jede Probe wurde berechnet, indem das Zielbandsignal durch den entsprechenden Spurnormalisierungsfaktor dividiert wurde. Beispiele für repräsentative Spuren in voller Länge aus dem Western Blot (Gesamtproteinbeladungskontrolle und Zielprotein) finden Sie in den ergänzenden Abbildungen. 9 und 10.

ELISAs wurden unter Verwendung eines vorgefertigten kolorimetrischen Maus-α-syn-Sandwich-ELISA-Kits (LS Bio, LS-F6284-1) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Proben wurden 1:20 für SN, 1:20 für Striatum und 1:25 für Plasma im Probenverdünnungsmittel verdünnt. Standards und Proben wurden im Duplikat getestet. Mit den verbleibenden verdünnten Proben aus SN und Striatum wurde ein BCA-Assay durchgeführt und zur Normalisierung der Ergebnisse auf Protein verwendet. Die Absorption bei 450 nm wurde mit einem Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader abgelesen.

40 Mikrometer dicke koronale Hirngewebeschnitte wurden in TBS mit Triton X-100 (TBS-TX) gewaschen und 1 Stunde lang in Wasserstoffperoxid aus dem RNAscope Pretreatment Kit (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA; 322330) inkubiert. Die Schnitte wurden in TBS gewaschen und dann auf VistaVision HistoBond-Objektträger (VWR, Randor, PA; 16004-406) montiert und über Nacht auf einen Objektträgerwärmer bei 60 °C gelegt. Anschließend wurden die Objektträger 10 Minuten lang in Target-Retrieval-Puffer von ACD Biosciences bei 99 °C inkubiert und dann zweimal in Wasser gewaschen. Das Gewebe wurde mit Pap Pen (Abcam, Cambridge, UK; ab2601) umrissen, mit ACD-Protease plus in einem Hybridisierungsofen bei 40 °C 15 Minuten lang inkubiert, zweimal in Wasser gewaschen und mit der Sonde für Ratten-Adrb2 (Kat.-Nr.: 468131, Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA; 457731) für 2 Stunden im Hybridisierungsofen bei 40 °C, gefolgt von Wäschen in ACD-Waschpuffer. Anschließend wurden sechs Amplifikationsschritte mit den Amplifikationspuffern (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA; 322300) in abwechselnden Inkubationsintervallen von 30 und 15 Minuten im Hybridisierungsofen gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Das Gewebe wurde mit dem mitgelieferten DAB-Reagenz entwickelt, in TBS-TX gewaschen, durch aufsteigende Ethanolwaschungen geführt und mit Xylolen gereinigt. Die Objektträger wurden mit Cytoseal 60 abgedeckt und mit einem Nikon Eclipse 90i-Mikroskop mit einer QICAM-Kamera (QImaging, Surrey, British Columbia, Kanada) abgebildet.

Alle Lösungsmittel waren von LC-MS-Qualität und wurden von Fisher Scientific bezogen. Alle anderen Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Spinfilter wurden von Millipore Sigma gekauft. Pro Probe wurden 100 μL Rattenplasma und 50 μL Mausplasma verwendet. Das Plasma wurde mit 4:1 eiskaltem Aceton bei –20 °C über Nacht ausgefällt. Nach der Zentrifugation (18.000 × g, 2 Min.) wurde der Überstand entfernt und vollständig getrocknet (30 °C unter Verwendung einer Vakuumzentrifuge). Die Proben wurden in 300 µL 0,1 %iger Ameisensäure resuspendiert. Unlösliche Partikel wurden durch Filtration mit einem 3-kDa-Cutoff-Spinfilter entfernt. Der Durchfluss wurde vollständig getrocknet und in 20 μl 0,1 % Ameisensäure, 2 % ACN, mit 2,5 ng/ml schwerem Clenbuterol-d9 resuspendiert. Kalibrierungskurven wurden durch Mischen von unbehandeltem Plasma von 5 Tieren (Ratte oder Maus) und Anreichern des gemischten Plasmas mit Clenbuterol in Konzentrationen von 0,06, 0,2, 0,6, 2,0, 6,0, 20,0, 60,0 und 200,0 ng/ml erstellt. Alle Experimente wurden auf einem Thermo Scientific™ Q Exactive™ HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Massenspektrometer mit einem Thermo Scientific™ UltiMate™ 3000 UHPLC-System durchgeführt. Jede Analyse besteht aus drei 15-minütigen Umkehrphasengradienten mit 2 µl Probeninjektionen. Für die Trennungen wird eine 15 cm C18 EasySpray-Säule verwendet. Die Proben werden zur Online-Entsalzung vor der chromatographischen Trennung auf eine 5-mm-C18-Fallenkartusche geladen. Die Proben wurden in dreifacher Ausfertigung entnommen.

Die massenspektrometrische Analyse nutzte den PRM-Scanmodus zur Isolierung und Fragmentierung von Clenbuterol (277,08690 m/z) und schwerem Clenbuterol (286,14339 m/z). Fragmentmassenspektren wurden mit einer Auflösung von 15.000 (200 m/z), einer AGC von 2e5 und einer maximalen Injektionszeit von 100 ms aufgenommen. Peptide wurden mit Stufenkollision NCE 25, 50 und einem Isolationsfenster von 1,3 m/z fragmentiert. Die Elektrosprayspannung betrug 1,9 kV. Peakpicking und Flächenberechnungen wurden mit Skyline Version 4.2 durchgeführt. Alle Peaks werden manuell validiert. The summed peak areas of clenbuterol fragments 203.01373 m/z, 168.044877 m/z, and 132.068199 m/z, normalized to the summed peak areas of heavy clenbuterol fragments 204.020006 m/z, 169.051154 m/z, and 133.074476 m/z are used zur Quantifizierung.

Alle Lösungsmittel waren von LC-MS-Qualität und wurden von Fisher Scientific bezogen. Alle anderen Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Spinfilter wurden von Millipore Sigma gekauft. 5–10 mg-Stanzen Gehirngewebe wurden in „gebundene“ und „ungebundene“ Fraktionen sequestriert. Die „gebundenen“ Fraktionen stellen proteingebundenes Clenbuterol dar, beispielsweise die Wechselwirkung mit β2AR. Die Vorbereitung der „Gesamtfraktionen“, „Ungebundenen“ und „Gebundenen“ Fraktionen für jede Probe erfolgt wie folgt. Alle Manipulationen wurden auf Eis durchgeführt. Die Proben wurden durch 10-sekündige Ultraschallbehandlung in 200 μl 25 mM Ammoniumbicarbonat (AMBIC), pH 8, lysiert. 10 μl Überstand wurden als Darstellung des „Gesamt“-Clenbuterols entnommen und beiseite gestellt. Die Proben wurden zentrifugiert (18 K × G, 10 Min.). Der verbleibende Überstand wurde ohne Spülen schleuderfiltriert (3 kDa 18 K × G, 10 min). Der Durchfluss wurde als „ungebundene“ Fraktionen gesammelt. Auf dem Filter zurückgehaltenes Material wurde durch Umkehrschleudern (18 K × G, 2 Min.) als „gebundene“ Fraktionen gesammelt. Das pelletierte Gehirnmaterial wurde mit 200 μl 60 % ACN, 30 % MeOH, 10 % 25 mM AMBIC, pH 8, extrahiert, 10 s lang beschallt und zentrifugiert (18 K × G, 10 min). Der Überstand wurde entfernt und mit den „gebundenen“ Fraktionen kombiniert. Proteine ​​aus den Fraktionen „Gesamt“, „Ungebunden“ und „Gebunden“ wurden mit 5:1 eiskaltem Aceton bei –20 °C über Nacht ausgefällt. Nach der Zentrifugation (18 K × G, 10 min) wurde der Überstand entfernt und vollständig getrocknet (30 °C unter Verwendung einer Vakuumzentrifuge). „Ungebundene“ Fraktionen wurden in 20 μl 0,1 % FA, 2 % ACN mit 2,5 ng/ml schwerem Clenbuterol-d9 resuspendiert. „Gebundene“ Fraktionen wurden in 20 μl 0,1 % FA, 2 % ACN mit 2,5 ng/ml schwerem Clenbuterol-d9 resuspendiert. 180 μl 0,1 % FA wurden hinzugefügt, schleuderfiltriert, vollständig getrocknet und in 20 μl 0,1 % FA, 2 % ACN resuspendiert.

„Gesamt“-Fraktionen wurden in 200 μl 0,1 % Ameisensäure resuspendiert, schleuderfiltriert, vollständig getrocknet und in 20 μl 0,1 % FA, 2 % ACN mit 2,5 ng/ml schwerem Clenbuterol-d9 resuspendiert. „Ungebundene“ und „gebundene“ Kalibrierungskurven wurden erstellt, indem 10 mg unbehandeltes Gehirngewebe von 10 Mäusen kombiniert, in 2 ml Puffer beschallt, das Lysat in zehn Proben aufgeteilt und 10 μl aus jedem Aliquot entnommen wurden. Aliquots wurden durch Spinfiltration wie oben beschrieben in „ungebundene“ und „gebundene“ Fraktionen getrennt. Jede Fraktion wurde dann mit Clenbuterol in Konzentrationen von 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0, 100,0, 300,0 pg, 1,0, 3,0 und 10,0 ng versetzt. Clenbuterol wurde wie oben beschrieben extrahiert.

Die „Gesamt“-Kalibrierungskurve wurde erstellt, indem 10 mg unbehandeltes Gehirngewebe von acht Mäusen kombiniert, in 1,6 ml Puffer beschallt, das Lysat in 8 Proben aliquotiert und mit Clenbuterol in Konzentrationen von 3,0, 10,0, 30,0, 100,0, 300,0 pg versetzt wurden. 1,0, 3,0 und 10,0 ng.

Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism Version 7.03 durchgeführt und die Signifikanz für alle Fälle wurde mit α ≤ 0,05 ermittelt. Ausreißer wurden anhand der absoluten Abweichung von der Medianmethode78 bewertet, wobei als Ausschlusskriterium eine „sehr konservative“ Differenz von 2,5X der mittleren absoluten Abweichung verwendet wurde. Experimente mit zwei Gruppen (d. h. Kochsalzlösungskontrolle und Clenbuterol) wurden mithilfe eines zweiseitigen t-Tests analysiert. Experimente mit mehreren Gruppen zu einem einzigen Zeitpunkt (z. B. Kochsalzlösungskontrolle, 10, 20 und 40 mg/kg Clenbuterol) wurden mit einer einfaktoriellen ANOVA und Post-hoc-Tukey-Tests für mehrere Vergleiche analysiert. Experimente mit mehreren Gruppen zum Zeitpunkt 1 Tag und 1 Woche wurden mit einer Zwei-Wege-ANOVA und Post-hoc-Tukey-Tests für mehrere Vergleiche analysiert. Die Analyse der Gewichtsveränderungen wurde mit einer Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen und einem Post-hoc-Sidak-Test (Mäuse) oder einem Tukey-Test (Ratte) für mehrere Vergleiche durchgeführt. Alle Gruppenmittelwerte, Standardfehler und statistischen Testinformationen für alle Ergebnisse finden Sie im ergänzenden Statistikdokument.

Sprague-Dawley E18 primäre kortikale Neuronen der Ratte wurden mit 50 K-Zellen pro Vertiefung in einer mit Poly-D-Lysin beschichteten Platte mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Bei DIV11 wurden DMSO-Vehikel oder Clenbuterol (1, 5, 10 oder 20 µM Endkonzentration in der Vertiefung) hinzugefügt. Zwei Tage später, bei DIV 13, wurden die Zellen mit PBS gewaschen, dann wurden 175 µL RLT Plus-Puffer mit 0,1 % β-Mercaptoethanol in jede Vertiefung gegeben. Nach der Kombination von 2 Wells pro Probe sollte ein Qiagen RNeasy Plus Mini Kit gepaart mit einem QiaCube RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahieren. Für die cDNA-Synthese wurden 16 µL RNA zu 4 µL 5x iScript RT Supermix (Bio-Rad) gegeben und in einen Thermocycler gegeben (5 Min. bei 25 °C, 30 Min. bei 42 °C, 1 Min. bei 85 °C). bei 4 °C halten). Multiplex TaqMan RT-qPCR wurde verwendet, um die relative Genexpression in einem 10-µL-Reaktionsvolumen mit einem ROX-Referenzfarbstoff zu quantifizieren. Es wurden ein benutzerdefinierter Ratten-Snca-Primer (vorwärts: CTGTACCTGCCCCTCAGCAT; rückwärts: AGCCTGCTACCATGTATTCACTGTAG; Sonde: CGGTGCTCCCCTCT) und kommerzielle Xpnpep1-Primer/Sonden-Sets (Applied Biosystems Rn00590960_m1) verwendet. Die Amplifikation von Snca wurde auf die von Xpnpep1 normalisiert. Die Fold-Change-Werte wurden unter Verwendung der ΔΔCt-Methode berechnet und das Verhältnis von Arzneimittel- zu Kontrollproben ausgedrückt. Die Daten wurden mit dem Cloud-Webtool Thermo Fisher Connect und Microsoft Excel analysiert. Der CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, um die Toxizität von Behandlungen zu bewerten.

C57BL/6 J-Mäuse (n = 24: zehn Kochsalzlösung und 14 Clenbuterol) erhielten eine einzelne ip-Injektion von 10 mg/kg Clenbuterol oder das gleiche Volumen Kochsalzlösung als Kontrolle. Die Tiere wurden 24 Stunden nach der Dosierung eingeschläfert, das Gehirn entfernt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Gehirne wurden auf einem Kryostat geschnitten und gefrorene Stanzen des SN gesammelt. Gewebestanzen wurden in QIAzol unter Verwendung eines Omni Bead Disruptors homogenisiert (45 s an, 30 s aus, 45 s an). Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur wurden 200 µL Chloroform zugegeben und die Proben 15 Sekunden lang gevortext. Nach 3 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Proben 15 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 U/min zentrifugiert. 400 µL der resultierenden wässrigen Schicht wurden mit einem gleichen Volumen 70 % Ethanol kombiniert und die RNA anschließend mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die reverse Transkription von 300 ng RNA wurde in einem Reaktionsvolumen von 20 µL unter Verwendung des SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher) durchgeführt. Dieses Reaktionsvolumen wurde 1:2 mit Wasser verdünnt, bevor 2 µL in eine 10 µL qPCR-Reaktion geladen wurden, die 5 µL TaqMan Gene Expression Master Mix (Thermo Fisher, 4369016) und 0,2 µM genspezifischen TaqMan-Assay enthielt. TaqMan-Primer/Sonde, identisch mit denen von Mittal et al37, wurden für Snca (Applied Biosystems Mm01188700_m1) verwendet, das entweder auf Rpl13a (Applied Biosystems Mm02342645_g1), Actb (Applied Biosystems Mm00607939_s1) oder Ubc (Applied Biosystems Mm01198158_m1) normalisiert wurde. . Für alle Proben wurde das interessierende Gen auf das Referenzgen oder das geometrische Mittel der drei Referenzgene normalisiert. ActB und Ubc wurden aufgrund ihrer stabilen Expression, ihrer bekannten Verwendung als Haushaltsgene und aufgrund ihrer vorherigen Verwendung im Originalbericht, auf dem diese Studie basiert, ausgewählt37. In ähnlicher Weise wurde auch Rpl13a verwendet, da das verwandte Gen Rpl13 im vorherigen Bericht als eines der Referenzgene verwendet wurde37. Die Verwendung verschiedener Referenzgene zur Normalisierung hatte keinen Einfluss auf die Gesamtergebnisse. Ergebnisse mit Housekeeping-Genen, die nicht im Hauptmanuskript aufgeführt sind, finden Sie in der ergänzenden Abbildung 8.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Statistische Testinformationen zu allen Ergebnissen finden Sie im ergänzenden Statistikdokument. Die Daten, die die Ergebnisse dieses Artikels stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Graybiel, AM, Hirsch, EC & Agid, Y. Das nigrostriatale System bei der Parkinson-Krankheit. Adv. Neurol. 53, 17–29 (1990).

CAS PubMed Google Scholar

Pollanen, MS, Dickson, DW & Bergeron, C. Pathologie und Biologie des Lewy-Körpers. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 52, 183–191 (1993).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Spillantini, MG et al. Alpha-Synuclein in Lewy-Körpern. Nature 388, 839–840 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fahn, S. Beschreibung der Parkinson-Krankheit als klinisches Syndrom. Ann. N. Y. Acad. Wissenschaft. 991, 1–14 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jankovic, J. Parkinson-Krankheit: klinische Merkmale und Diagnose. J. Neurol. Neurochirurg. Psychiatrie 79, 368–376 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Polymeropoulos, MH et al. Mutation im Alpha-Synuclein-Gen, festgestellt in Familien mit Parkinson-Krankheit. Science 276, 2045–2047 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Conway, KA, Harper, JD & Lansbury, PT Beschleunigte In-vitro-Fibrillenbildung durch ein mutiertes Alpha-Synuclein im Zusammenhang mit der früh einsetzenden Parkinson-Krankheit. Nat. Med. 4, 1318–1320 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ostrerova-Golts, N. et al. Die A53T-Alpha-Synuclein-Mutation erhöht die eisenabhängige Aggregation und Toxizität. J. Neurosci. 20, 6048–6054 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Singleton, AB et al. Die Verdreifachung des Alpha-Synuclein-Locus verursacht die Parkinson-Krankheit. Wissenschaft 302, 841 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ross, OA et al. Genomische Untersuchung der Alpha-Synuclein-Vermehrung und Parkinsonismus. Ann. Neurol. 63, 743–750 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cabin, DE et al. Die Erschöpfung synaptischer Vesikel korreliert mit abgeschwächten synaptischen Reaktionen auf längere wiederholte Stimulation bei Mäusen, denen Alpha-Synuclein fehlt. J. Neurosci. 22, 8797–8807 (2002).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Murphy, DD, Rueter, SM, Trojanowski, JQ & Lee, VM Synucleine werden in der Entwicklung exprimiert und Alpha-Synuclein reguliert die Größe des präsynaptischen Vesikelpools in primären Hippocampus-Neuronen. J. Neurosci. 20, 3214–3220 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nemani, VM et al. Eine erhöhte Expression von Alpha-Synuclein verringert die Freisetzung von Neurotransmittern, indem es die Reclusterbildung synaptischer Vesikel nach der Endozytose hemmt. Neuron 65, 66–79 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, BM, Avadhani, NG & Anandatheerthavarada, HK Mitochondrialer Import und Akkumulation von Alpha-Synuclein beeinträchtigen Komplex I in menschlichen dopaminergen neuronalen Kulturen und im Gehirn der Parkinson-Krankheit. J. Biol. Chem. 283, 9089–9100 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pozo Devoto, VM & Falzone, TL Mitochondriale Dynamik bei der Parkinson-Krankheit: eine Rolle für Alpha-Synuclein? Dis. Modell Mech. 10, 1075–1087 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guardia-Laguarta, C. et al. Alpha-Synuclein ist in mitochondrienassoziierten ER-Membranen lokalisiert. J. Neurosci. 34, 249–259 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Iwata, A., Maruyama, M., Kanazawa, I. & Nukina, N. Alpha-Synuclein beeinflusst den MAPK-Signalweg und beschleunigt den Zelltod. J. Biol. Chem. 276, 45320–45329 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Scott, DA et al. Eine pathologische Kaskade, die zu einer synaptischen Dysfunktion bei der Alpha-Synuclein-induzierten Neurodegeneration führt. J. Neurosci. 30, 8083–8095 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schaser, AJ et al. Alpha-Synuclein ist ein DNA-bindendes Protein, das die DNA-Reparatur moduliert und Auswirkungen auf Lewy-Körper-Erkrankungen hat. Wissenschaft. Rep. 9, 10919 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Pozo Devoto, VM et al. Die Kontrolle der mitochondrialen Homöostase in vom Menschen stammenden Neuronen durch AlphaSynuclein wird durch Mutationen im Zusammenhang mit der Parkinson-Krankheit gestört. Wissenschaft. Rep. 7, 5042 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Benskey, MJ, Perez, RG & Manfredsson, FP Der Beitrag von Alpha-Synuclein zum neuronalen Überleben und zur neuronalen Funktion – Auswirkungen auf die Parkinson-Krankheit. J. Neurochem. 137, 331–359 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Khodr, CE, Becerra, A., Han, Y. & Bohn, MC Targeting von Alpha-Synuclein mit einem in microRNA eingebetteten Silencing-Vektor in der Substantia nigra der Ratte: positive und negative Auswirkungen. Gehirnres. 1550, 47–60 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sulzer, D. & Edwards, RH Die physiologische Rolle von α-Synuclein und seine Beziehung zur Parkinson-Krankheit. J. Neurochem. 150, 475–486 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Burré, J. et al. Alpha-Synuclein fördert den SNARE-Komplex-Aufbau in vivo und in vitro. Science 329, 1663–1667 (2010).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Anwar, S. et al. Funktionelle Veränderungen des nigrostriatalen Systems bei Mäusen, denen alle drei Mitglieder der Synuclein-Familie fehlen. J. Neurosci. 31, 7264–7274 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Greten-Harrison, B. et al. αβγ-Synuclein-Triple-Knockout-Mäuse zeigen altersabhängige neuronale Dysfunktion. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 107, 19573–19578 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guschina, IA, Ninkina, N., Roman, A., Pokrovskiy, MV & Buchman, VL Triple-Knockout-Mäuse ohne Synuclein zeigen ein beeinträchtigtes Lipidmuster. Molecules 26, 3078 (2021).

Kuhn, M. et al. Gesamtgenom-Expressionsanalysen von Single- und Double-Knock-out-Mäusen deuten auf teilweise überlappende Funktionen von Alpha- und Gamma-Synuclein hin. Neurogenetics 8, 71–81 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Benskey, MJ et al. Die Stummschaltung von Alpha-Synuclein in reifen Nigralneuronen führt zu einer schnellen Neuroinflammation und anschließender Toxizität. Vordermol. Neurosci. 11, 36 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Gorbatyuk, OS et al. In vivo induziert die RNAi-vermittelte Alpha-Synuclein-Stummschaltung eine nigrostriatale Degeneration. Mol. Dort. 18, 1450–1457 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zharikov, A. et al. Langfristiger RNAi-Knockdown von α-Synuclein in der Substantia nigra erwachsener Ratte ohne Neurodegeneration. Neurobiol. Dis. 125, 146–153 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McCormack, AL et al. Alpha-Synuclein-Unterdrückung durch gezielte kleine interferierende RNA in der Substantia nigra von Primaten. PLoS One 5, e12122 (2010).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Lewis, J. et al. In-vivo-Stummschaltung von Alpha-Synuclein mithilfe nackter siRNA. Mol. Neurodegener. 3, 19 (2008).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Cole, TA et al. Alpha-Synuclein-Antisense-Oligonukleotide als krankheitsmodifizierende Therapie der Parkinson-Krankheit. JCI Insight 6, e135633 (2021).

Becker, C., Jick, SS & Meier, CR Einsatz von Antihypertensiva und das Risiko einer Parkinson-Krankheit. Neurology 70, 1438–1444 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ritz, B. et al. L-Typ-Kalziumkanalblocker und Parkinson-Krankheit in Dänemark. Ann. Neurol. 67, 600–606 (2010).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mittal, S. et al. Beta2-Adrenorezeptor ist ein Regulator des Alpha-Synuclein-Gens, das das Risiko für die Parkinson-Krankheit erhöht. Wissenschaft 357, 891–898 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gronich, N. et al. Beta2-Adrenozeptor-Agonisten und -Antagonisten und Risiko für die Parkinson-Krankheit. Mov. Unordnung. 33, 1465–1471 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Searles Nielsen, S., Gross, A., Camacho-Soto, A., Willis, AW & Racette, BA Beta2-Adrenorezeptor-Medikamente und das Risiko einer Parkinson-Krankheit. Ann. Neurol. 84, 683–693 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

de Germay, S., Conte, C., Rascol, O., Montastruc, JL & Lapeyre-Mestre, M. Beta-Adrenozeptor-Medikamente und Parkinson-Krankheit: eine landesweite verschachtelte Fall-Kontroll-Studie. CNS Drugs 34, 763–772 (2020).

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Yamamoto, I., Iwata, K. & Nakashima, M. Pharmakokinetik von Plasma- und Urin-Clenbuterol bei Menschen, Ratten und Kaninchen. J. Pharmacobiodyn 8, 385–391 (1985).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

January, B. et al. Desensibilisierung, Internalisierung und Phosphorylierung des beta2-adrenergen Rezeptors als Reaktion auf vollständige und partielle Agonisten. J. Biol. Chem. 272, 23871–23879 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nobles, KN ​​et al. Eindeutige Phosphorylierungsstellen am beta(2)-adrenergen Rezeptor bilden einen Barcode, der die unterschiedlichen Funktionen von Beta-Arrestin kodiert. Wissenschaft. Signal. 4, ra51 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kitayama, S. et al. MPP+-Toxizität und Plasmamembran-Dopamintransporter: Studie mit Zelllinien, die Wildtyp- und mutierte Ratten-Dopamintransporter exprimieren. Biochim Biophys. Acta 1404, 305–313 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kitayama, S., Wang, JB & Uhl, GR Dopamintransportermutanten verstärken selektiv den MPP+-Transport. Synapse 15, 58–62 (1993).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ton, TG et al. Kalziumkanalblocker und Betablocker im Zusammenhang mit der Parkinson-Krankheit. Park. Verwandt. Unordnung. 13, 165–169 (2007).

Artikel Google Scholar

Thenganatt, MA & Jankovic, J. Die Beziehung zwischen essentiellem Tremor und der Parkinson-Krankheit. Park. Verwandt. Unordnung. 22, S162–S165 (2016).

Artikel Google Scholar

Qian, L. et al. Die Aktivierung des beta2-adrenergen Rezeptors verhindert die dopaminerge Neurotoxizität von Nagetieren, indem sie Mikroglia über einen neuartigen Signalweg hemmt. J. Immunol. 186, 4443–4454 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Forno, LS, DeLanney, LE, Irwin, I. & Langston, JW Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen MPTP-induziertem Parkinsonismus und der Parkinson-Krankheit. Neuropathologische Überlegungen. Adv. Neurol. 60, 600–608 (1993).

CAS PubMed Google Scholar

Dauer, W. & Przedborski, S. Parkinson-Krankheit: Mechanismen und Modelle. Neuron 39, 889–909 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dauer, W. et al. Resistenz von α-Synuclein-Nullmäusen gegenüber dem Parkinson-Neurotoxin MPTP. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 99, 14524–14529 (2002).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mogilnicka, E. & Nielsen, M. Wiederholte Behandlung mit Clenbuterol führt zu einer Desensibilisierung der Beta- und Alpha-2-Adrenozeptoren des Rattenhirns ohne Veränderungen der Alpha-1-Adrenozeptoren. EUR. J. Pharm. 121, 107–111 (1986).

Artikel CAS Google Scholar

Kazanietz, MG & Enero, MA Desensibilisierung der Beta-2-Adrenozeptor-vermittelten Vasodilatation in der Rattenaorta nach längerer Behandlung mit dem Beta-2-Adrenozeptor-Agonisten Clenbuterol. J. Pharm. Exp. Dort. 252, 758–764 (1990).

CAS Google Scholar

Mills, SE & Orcutt, AL Clenbuterol-induzierte Desensibilisierung in murinen Adipozyten: Zusammenhang mit der In-vivo-Wirksamkeit. Inland. Anim. Endokrinol. 6, 51–58 (1989).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Preissner, S. et al. SuperCYP: eine umfassende Datenbank zu Cytochrom-P450-Enzymen, einschließlich eines Tools zur Analyse von CYP-Arzneimittelinteraktionen. Nukleinsäuren Res. 38, D237–D243 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Takahashi, K., Akiba, Y. & Horiguchi, M. Auswirkungen eines beta-adrenergen Agonisten (Clenbuterol) auf Leistung, Schlachtkörperzusammensetzung, hepatische mikrosomale Mischfunktionsoxidase und Antikörperproduktion bei weiblichen Broilern, die mit oder ohne Corticosteron behandelt wurden. Br. Geflügel. Wissenschaft. 34, 167–175 (1993).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Waight, M. & McGuinness, W. Fall einer Clenbuterol-Toxizität in niedriger Dosis. BMJ-Fallvertreter. https://doi.org/10.1136/bcr-2016-21 (2016).

Huckins, DS & Lemons, MF Myokardischämie im Zusammenhang mit Clenbuterol-Missbrauch: Bericht über zwei Fälle. J. Emerg. Med. 44, 444–449 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Lehmann, S. et al. Tod nach Missbrauch anaboler Substanzen (Clenbuterol, Stanozolol und Metandienon). Forensische Wissenschaft. Int. 303, 109925 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Spiller, HA, James, KJ, Scholzen, S. & Borys, DJ Eine deskriptive Studie über unerwünschte Ereignisse durch den Missbrauch von Clenbuterol zur Gewichtsabnahme und zum Bodybuilding. Subst. Ein Bus. 34, 306–312 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Burniston, JG et al. Myotoxische Wirkungen von Clenbuterol auf das Herz und den Soleusmuskel der Ratte. J. Appl Physiol. 93, 1824–1832 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Duncan, ND, Williams, DA & Lynch, GS Schädliche Auswirkungen einer chronischen Behandlung mit Clenbuterol auf die Ausdauer- und Sprintleistung bei Ratten. Klin. Wissenschaft. 98, 339–347 (2000).

Artikel CAS Google Scholar

Alexander, GM, Schwartzman, RJ, Nukes, TA, Grothusen, JR & Hooker, MD Beta-2-adrenerger Agonist als Zusatztherapie zu Levodopa bei der Parkinson-Krankheit. Neurology 44, 1511–1513 (1994).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Beta-Adrenergika von Uc, EY, Dienel, GA, Cruz, NF und Harik, SI verbessern die Gehirnextraktion von Levodopa. Mov. Unordnung. 17, 54–59 (2002).

Artikel PubMed Google Scholar

Eriksson, T. & Carlsson, A. Beta-adrenerge Kontrolle der Gehirnaufnahme großer neutraler Aminosäuren. Lebenswissenschaft. 42, 1583–1589 (1988).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Olesen, J., Hougard, K. & Hertz, M. Isoproterenol und Propranolol: Fähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden und Auswirkungen auf die Gehirndurchblutung beim Menschen. Strich 9, 344–349 (1978).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Edwards, DJ, Sorisio, DA & Knopf, S. Auswirkungen des Beta-2-Adrenozeptor-Agonisten Clenbuterol auf Tyrosin und Tryptophan im Plasma und Gehirn der Ratte. Biochem Pharm. 38, 2957–2965 (1989).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hishida, R., Kurahashi, K., Narita, S., Baba, T. & Matsunaga, M. „Wearing-off“ und Beta-2-Adrenozeptor-Agonist bei der Parkinson-Krankheit. Lancet 339, 870 (1992).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Van Laar, AD et al. Die pharmakogenomische Reduktion von Alpha-Synuclein mit dem Beta2-Adrenorezeptor-Agonisten wirkt in einem verzögerten Rotenon-Modell der Parkinson-Krankheit schützend. Soc. Neurosci. 655, 21 (2018).

Gleeson, LC, Ryan, KJ, Griffin, EW, Connor, TJ & Harkin, A. Der Beta2-Adrenozeptor-Agonist Clenbuterol löst im Kainsäuremodell der Exzitotoxizität neuroprotektive, entzündungshemmende und neurotrophe Wirkungen aus. Gehirnverhalten. Immun. 24, 1354–1361 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fujita, H., Tanaka, J., Maeda, N. & Sakanaka, M. Adrenerge Agonisten unterdrücken die Proliferation von Mikroglia durch den Beta-2-adrenergen Rezeptor. Neurosci. Lette. 242, 37–40 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Izeboud, CA, Mocking, JA, Monshouwer, M., van Miert, AS & Witkamp, ​​RF Beteiligung beta-adrenerger Rezeptoren auf Makrophagen an der Modulation der LPS-induzierten Zytokinfreisetzung. J. Empfangssignaltransduktor. Res. 19, 191–202 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Izeboud, CA, Monshouwer, M., van Miert, AS & Witkamp, ​​RF Der Beta-Adrenozeptor-Agonist Clenbuterol ist ein wirksamer Inhibitor der LPS-induzierten Produktion von TNF-alpha und IL-6 in vitro und in vivo. Entzündung. Res. 48, 497–502 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Culmsee, C., Semkova, I. & Krieglstein, J. NGF vermittelt die neuroprotektive Wirkung des Beta2-Adrenozeptor-Agonisten Clenbuterol in vitro und in vivo: Beweise aus einer NGF-Antisense-Studie. Neurochem. Int. 35, 47–57 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Culmsee, C., Stumm, RK, Schafer, MK, Weihe, E. & Krieglstein, J. Clenbuterol induziert Wachstumsfaktor-mRNA, aktiviert Astrozyten und schützt Rattenhirngewebe vor ischämischen Schäden. EUR. J. Pharm. 379, 33–45 (1999).

Artikel CAS Google Scholar

Culmsee, C. et al. Kombinationstherapie bei ischämischem Schlaganfall: synergistische neuroprotektive Wirkung von Memantin und Clenbuterol. Strich 35, 1197–1202 (2004).

Artikel PubMed Google Scholar

Teng, YD et al. Therapeutische Wirkungen von Clenbuterol in einem Mausmodell der amyotrophen Lateralsklerose. Neurosci. Lette. 397, 155–158 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Leys, C., Ley, C., Klein, O., Bernard, P. & Licata, L. Ausreißer erkennen: Verwenden Sie keine Standardabweichung um den Mittelwert, sondern eine absolute Abweichung um den Median. J. Exp. Soc. Psychol. 49, 764–766 (2013).

Artikel Google Scholar

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Diese Studie wurde von der Michael J. Fox Foundation für das Parkinson Research Target Advancement Program unterstützt. Die Autoren möchten außerdem Dr. Andrew Koemeter-Cox von der Michael J. Fox Foundation for Parkinson’s Research für seine zusätzlichen Einblicke in das Projekt und für die Erleichterung von Diskussionen zwischen Laboren danken.

Abteilung für translationale Neurowissenschaften, Michigan State University, Grand Rapids, MI, USA

Joseph R. Patterson, Jacob W. Howe, Allyson Cole-Strauss, Christopher J. Kemp, Megan F. Duffy, Jared Lamp, Andrew Umstead, Michael Kubik, Anna C. Stoll, Irving E. Vega, Kathy Steece-Collier und Caryl E. Sortwell

Forschungseinheit für neurodegenerative Erkrankungen, Biogen, Cambridge, MA, USA

Warren D. Hirst, Yi Chen, Anne C. Campbell, Catherine L. Nezich und Kelly E. Glajch

Neurowissenschaftliches Programm, Michigan State University, East Lansing, MI, USA

Jacob W. Howe, Megan F. Duffy, Michael Kubik und Caryl E. Sortwell

Abteilung für Zell- und Molekularbiologie, Grand Valley State University, Allendale, MI, USA

Christopher P. Russell

Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie, Michigan State University, East Lansing, MI, USA

Anna C. Stoll

Mercy Health Hauenstein Neuroscience Medical Center, Grand Rapids, MI, USA

Caryl E. Sortwell

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Konzeptualisierung: JRP, WDH und CES. Untersuchung: JRP, JWH, CPR, ACS, CJK, MFD, JL, AU, MK, ACS, IEV, KSC, YC, ACC, CLN und KEG. Manuskriptvorbereitung (erster Entwurf): JRP und CES. Manuskriptvorbereitung (Überprüfung und Bearbeitung): JRP, WDH, CES, JWH, CJK, MFD, JL, AU, MK, ACS, IEV, KSC, YC, ACC, CLN und KEG.

Korrespondenz mit Joseph R. Patterson.

WDH, YC, ACC, CLN und KEG sind Mitarbeiter von Biogen Inc. Die Autoren geben an, dass keine weiteren konkurrierenden Interessen bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Patterson, JR, Hirst, WD, Howe, JW et al. Der Beta2-Adrenorezeptor-Agonist Clenbuterol führt zu einem vorübergehenden Rückgang der Alpha-Synuclein-mRNA, aber nicht zu einer langfristigen Verringerung des Proteins. npj Parkinsons Dis. 8, 61 (2022). https://doi.org/10.1038/s41531-022-00322-x

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Eingegangen: 24. Dezember 2021

Angenommen: 08. April 2022

Veröffentlicht: 24. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41531-022-00322-x

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