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Dec 17, 2023

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BMC Medicine Band 21, Artikelnummer: 90 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Präeklampsie (PE) ist eine der Hauptursachen für mütterliche und fetale Morbidität/Mortalität während der Schwangerschaft, und Alpha-2-Makroglobulin (A2M) wird mit Entzündungssignalen in Verbindung gebracht; Allerdings ist der pathophysiologische Mechanismus, durch den A2M an der PE-Entwicklung beteiligt ist, noch nicht geklärt.

Es wurden menschliche Plazentaproben, Serum und entsprechende klinische Daten der Teilnehmer gesammelt, um den pathophysiologischen Mechanismus zu untersuchen, der PE zugrunde liegt. Trächtigen Sprague-Dawley-Ratten wurde am Gestationstag (GD) 8,5 intravenös ein Adenovirus-Vektor injiziert, der A2M über die Schwanzvene trägt. Glatte Muskelzellen der menschlichen Nabelarterie (HUASMCs), Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene (HUVECs) und HTR-8/SVneo-Zellen wurden mit A2M-exprimierenden Adenovirusvektoren transfiziert.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die A2M-Spiegel im Serum von PE-Patienten, in den Uterusspiralarterien und im feto-plazentaren Gefäßsystem signifikant erhöht waren. Das Rattenmodell mit A2M-Überexpression ahmte die Merkmale von PE (dh Bluthochdruck in der mittleren bis späten Trächtigkeit, histologische und ultrastrukturelle Anzeichen einer Nierenschädigung, Proteinurie und Wachstumsbeschränkung des Fötus) sehr gut nach. Im Vergleich zur normalen Gruppe erhöhte die A2M-Überexpression den Gefäßwiderstand der Uterusarterie signifikant und beeinträchtigte den Umbau der Uterusspiralarterie sowohl bei schwangeren Frauen mit früh einsetzender LE als auch bei trächtigen Ratten. Wir fanden heraus, dass die Überexpression von A2M positiv mit der HUASMC-Proliferation verbunden war und negativ mit der Zellapoptose korrelierte. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass die Signalübertragung des transformierenden Wachstumsfaktors Beta 1 (TGFβ1) die oben beschriebenen Auswirkungen von A2M auf die Proliferation von Gefäßmuskelzellen reguliert. Unterdessen verringerte die Überexpression von A2M die Plazentavaskularisierung bei Ratten und verringerte die Expression von Genen, die mit der Angiogenese in Zusammenhang stehen. Darüber hinaus reduzierte die A2M-Überexpression die HUVEC-Migration, die Anzahl/Länge der Filopodien und die Röhrenbildung. Darüber hinaus hing die HIF-1α-Expression positiv mit A2M zusammen, und die Sekretion von sFLT-1 und PIGF plazentaren Ursprungs stand in engem Zusammenhang mit PE während der Schwangerschaft oder der A2M-Überexpression bei Ratten.

Unsere Daten zeigten, dass die Überexpression von A2M in der Schwangerschaft als ein Faktor angesehen werden kann, der zu PE führt und eine nachweisliche Umgestaltung der Uterusspiralarterien und eine fehlerhafte Plazentavaskularisierung verursacht.

Peer-Review-Berichte

Als multifaktorielle Erkrankung ist PE eine schwerwiegende Blutdruckerkrankung, die bei schwangeren Frauen nach der 20. Schwangerschaftswoche mit übermäßiger Proteinurie oder Organfunktionsstörungen einhergeht; Der pathologische Mechanismus ist bislang kaum verstanden [1, 2]. Bemerkenswert ist, dass PE weltweit der dominierende Faktor für Morbidität und Mortalität bei Müttern und Föten ist [3, 4], und die daraus resultierenden Risiken einer PE sind besonders schwerwiegend und gefährden das Leben von Müttern und ihren Babys [4]. Eine anhaltende Hypoxie in der Plazenta ist ein wesentlicher Faktor bei der Pathogenese der PE. Durch Hypoxie verursachter oxidativer Stress bei PE kann ein Ungleichgewicht zwischen proangiogenen Faktoren (wie dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und dem plazentalen Wachstumsfaktor [PlGF]) und antiangiogenen Faktoren (wie der löslichen fms-ähnlichen Tyrosinkinase-1 [sFlt1]) verursachen. , wodurch die Gefäßfunktion der Plazenta beeinträchtigt wird [5]. Darüber hinaus spielt das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) eine Schlüsselrolle beim hohen Blutdruck bei früh einsetzender PE, d. h. es besteht eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber zirkulierendem Angiotensin II (ANG II) [6]. Darüber hinaus sind im Vergleich zu normalen Schwangerschaften die Serumspiegel und Aktivitäten der meisten Komponenten des RAAS bei PE verringert, insbesondere die Spiegel der AT1R-Autoantikörper (AT1R-AA), Ang I, Ang II und Ang-(1-7) [ 7, 8]. Diese biologisch aktiven Moleküle verstärken die Vasokonstriktion der Widerstandsarterien in der Plazenta, was zu einer erhöhten Hypoxie bei PE führt.

Zunehmende Hinweise deuten darauf hin, dass die Entwicklung einer LE höchstwahrscheinlich auf die unzureichende Umgestaltung der Uterusspiralarterie während des Gefäßumbaus aufgrund dysfunktionaler Trophoblasten zurückzuführen ist [9]. Eine ordnungsgemäße Umgestaltung der Uterusspiralarterie wird erreicht, wenn die Störung der mütterlichen muskulären elastischen Wand der Gebärmutter die Invasion extravillöser Trophoblasten (EVTs) erleichtert, dh wenn epitheliale und vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) durch infiltrierende EVTs ersetzt werden [10]. Der aus uterinen natürlichen Killerzellen (uNK) gewonnene transformierende Wachstumsfaktor β1 (TGFβ1) reguliert die Apoptose und Migration von glatten Gefäßmuskelzellen, was eine ordnungsgemäße Umgestaltung der Spiralarterie gewährleistet [11]. Wenn dieser Prozess nicht korrekt abläuft, führt eine unzureichende Umgestaltung der Uterusspiralarterie zu einer Einschränkung der Blutversorgung der Plazenta und führt in der Folge zu einer Plazentahypoxie, die das Risiko einer PE erhöht [12].

Es wird angenommen, dass eine fehlerhafte Plazenta-Angiogenese an der Pathogenese der LE beteiligt ist [13]. Beispielsweise könnte die Unterdrückung der plazentaren Angiogenese mit Suramin (einem VEGF-Inhibitor), schwangerschaftsassoziiertem Plasmaprotein A2 (PAPP-A2) oder die Induktion von oxidativem Stress während der Schwangerschaft zu mütterlichem Bluthochdruck, plazentarer Dysfunktion und fetaler Wachstumsverzögerung führen, d. h. der diagnostische Index der LE [14,15,16]. Darüber hinaus führt die Aktivierung der Autophagie durch Herunterregulierung der Proteinkinase Cβ (PKCβ) zu einer beeinträchtigten Plazenta-Angiogenese und löst letztendlich PE-ähnliche Symptome bei Mäusen aus [17]. Zusammengenommen legen diese Daten die Bedeutung einer fehlerhaften Plazenta-Angiogenese für die Pathogenese von PE nahe.

A2M ist ein Serum-Panprotease-Inhibitor, der eine Rolle in einem einzigartigen „Einfang“-Mechanismus spielt [18,19,20]. Darüber hinaus übt A2M eine antiinfektiöse und entzündungshemmende Wirkung aus, indem es von Neutrophilen freigesetzte Proteasen einfängt und hemmt [21]. A2M wird hauptsächlich in der Leber synthetisiert und im Gehirn, im Herzen und im Fortpflanzungstrakt exprimiert. In diesen Geweben ist A2M an vielen physiologischen Funktionen und pathologischen Veränderungen beteiligt [18, 22, 23]. Eine Vielzahl wichtiger angiogenetischer Faktoren wird durch die Bindung an A2M inaktiviert, beispielsweise der basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), VEGF und PlGF [22]. Insbesondere kann A2M das Uterusgefäßsystem während der Schwangerschaft koordinativ regulieren [22], was uns dazu veranlasste, die biologischen Funktionen von A2M im Zusammenhang mit PE zu untersuchen. Wir gehen davon aus, dass die erhöhte A2M-Expression eine negative Rolle bei der Umgestaltung der Uterusspiralarterie und der Angiogenese der Plazenta während der Schwangerschaft spielen und so zur Entstehung von PE beitragen könnte.

Plazentagewebe wurde von 53 gesunden Schwangerschaften und 52 schwangeren Frauen mit früh einsetzender PE (diagnostiziert vor der 34. Schwangerschaftswoche) entnommen. Serumproben wurden von schwangeren Frauen in der Frühschwangerschaft (22 gesunde Schwangerschaften in der Normalgruppe und 18 Patienten mit frühem PE in der PE-Gruppe), in der mittleren Schwangerschaft (23 gesunde Schwangerschaften und 12 Patienten mit frühem PE) und in der Spätschwangerschaft (35) entnommen gesunde Schwangerschaften und 30 PE-Patientinnen im Frühstadium) und eine Woche nach der Entbindung (18 gesunde Schwangerschaften und 21 PE-Patientinnen im Frühstadium). Diese schwangeren Frauen, darunter gesunde Schwangerschaften und PE-Schwangerschaften im Frühstadium, wurden vom 1. Januar 2018 bis zum 23. Mai 2021 in der Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe des Overseas Hospital der Jinan-Universität, China, hospitalisiert. Die PE-Diagnose basierte auf den ausgegebenen Kriterien von der International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy (ISSHP) im Jahr 2018 [24]. Die Einschluss- und Ausschlusskriterien für die Gewebeentnahme sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Die Plazentazotten und das Dezidualgewebe wurden unmittelbar nach der Entbindung gesammelt, zwei- oder dreimal in eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, um das Blut zu entfernen, und zur weiteren Untersuchung mit flüssigem Stickstoff oder 4 % Paraformaldehyd fixiert. Das Plazentazottengewebe im ersten Schwangerschaftstrimester wurde aus Fällen unkomplizierter Schwangerschaften gewonnen und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Darüber hinaus wurde peripheres venöses Blut von schwangeren Frauen in der Normalgruppe und der Gruppe mit frühem PE zu drei Zeitpunkten der Schwangerschaft entnommen: 11–13+6 Schwangerschaftswochen, 14–27+6 Schwangerschaftswochen und die erste Tag der letzten Krankenhauseinweisung (in der Regel innerhalb einer Woche vor der Entbindung). Ab dem dritten Tag nach der Entbindung wurde postnatales Blut und unmittelbar nach der Entbindung Nabelschnurblut entnommen. Mutter- und Nabelschnurblut wurden in EDTA-Vakuum-Blutentnahmeröhrchen gesammelt und zentrifugiert (3000 × g, 4 °C, 15 Minuten), und der Überstand (dh Plasma) wurde extrahiert und zur weiteren Untersuchung bei –80 °C gelagert.

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Overseas Hospital der Jinan-Universität, China (Genehmigungsnummer: KY-2021-054) genehmigt und in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Von allen Studienteilnehmern wurde eine unterzeichnete Einverständniserklärung eingeholt.

SPF Sprague-Dawley-Ratten (6–8 Wochen alt, 180–200 g Gewicht) wurden von Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (SCXK 2012-0001, Peking, China) gekauft. Basierend auf einem früheren Bericht [25] haben wir ein A2M-Überexpressions-Rattenmodell mittels Schwanzveneninjektion erstellt, wie zuvor beschrieben [26]. Kurz gesagt, am Gestationstag (GD) 8,5 wurden Ratten (mit Ausnahme nicht schwangerer Ratten) Adenoviren injiziert, die A2M (OBiO Technology Co., Shanghai, China) exprimierten. Die Sequenzierungsergebnisse sind in der Zusatzdatei 1: Ergänzendes Ergebnis 1 aufgeführt. Wir injizierten eine adenovirale Dosis von etwa 1–2 × 109 pfu pro Tier und die Adenoviren wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf ein Gesamtvolumen von 400 μl gelöst. Die behandelten Ratten wurden zur weiteren Untersuchung auf GD19.5 (entsprechend dem dritten Trimester) getötet. Die folgenden Parameter wurden beurteilt: Blutdruck, Blutfluss und Proteinurie. Das primäre Ergebnis dieser Studie wird Bluthochdruck mit Blutdruckmessung sein. Sekundäre Ergebnisse umfassen Blutfluss, Proteinurie und histologische Analysen zur Messung der Morphologie und Zellfunktion der Spiralarterie und des Plazentagefäßes. Für die Rattenproben wurden die trächtigen Ratten zunächst eingeschläfert, um Plazenten und Föten zu sammeln. Gemäß dem Resource Equation Approach [27] wurden insgesamt 20 Ratten untersucht. Die Ratten wurden zufällig in zwei Gruppen aufgeteilt (n = 10 in jeder Gruppe): die Kontrollgruppe und die A2M-Überexpressionsgruppe (Hinweis: die in diesem Experiment verwendeten Ratten). stammten aus mindestens drei verschiedenen Modellierungschargen). Zufallszahlen wurden mit der Standardfunktion = RAND() in Microsoft Excel generiert. Jede Ratte wurde nach dem Experiment durch Genickbruch eingeschläfert. Tierversuche wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Alle experimentellen Prozesse mit Tierbehandlungen wurden gemäß den Verfahren der Ethikkommission für Tierversuche der Jinan-Universität (Genehmigungsnummer: 20210302-46) durchgeführt.

An jedem Tier waren mindestens sieben verschiedene Untersucher wie folgt beteiligt: ​​JW war die einzige Person, die über die Gruppenzuordnung auf der Grundlage der Randomisierungstabelle informiert war. PZ verabreichte mit Hilfe von JW intravenöse Injektionen in die Schwanzvene. Anschließend führte GW mit Unterstützung von XC die Datenanalyse durch. Schließlich waren PZ, GW, RL und XY (die die Gruppenzuordnung ebenfalls nicht kannten) für die Ergebnisbewertung verantwortlich.

Wie bereits beschrieben [28, 29] wurde der Blutdruck schwangerer Ratten bei Bewusstsein nach fünf aufeinanderfolgenden Trainingsperioden mit einem automatisierten computergestützten Schwanzmanschettensystem gemessen (Visitech BP2000, Visitech Systems, Inc., USA). Der Blutfluss in der Gebärmutterarterie der Ratte wurde mit einem hochauflösenden Ultraschallgerät (Esaote MyLab30 Gold, Esaote, Genua, Italien) gemessen, um zweidimensionale Bilder zu erhalten. Für die Urinproteinanalyse wurden 24-Stunden-Urinproben auf GD7.5 und GD19.5 gesammelt.

Die Hämatoxylin- und Eosin- (HE) und Periodsäure-Schiff-Färbung (PAS) wurde wie folgt durchgeführt. Die Gewebe wurden in 4 % Paraformaldehyd fixiert und anschließend in Paraffin eingebettet. Anschließend wurden 4 μm dicke Querschnitte verarbeitet und zur morphologischen Analyse mit HE oder PAS gefärbt.

Immunhistochemische und Immunfluoreszenzfärbungen wurden wie folgt durchgeführt. Menschliches oder Rattengewebe wurde in 4 % Paraformaldehyd fixiert, dehydriert, in Paraffinwachs eingebettet und seriell mit einer Dicke von 4 μm geschnitten. Die Schnitte wurden mit Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte mit fluoreszierenden Sekundärantikörpern angefärbt. Die Kerne wurden mit DAPI (Invitrogen) gefärbt. Die Schnitte wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus BX53, Tokio, Japan) abgebildet. Pro Gruppe wurden mindestens 5 Zufallsbilder aus 3 Proben analysiert. Die immunhistochemische statistische Analyse wurde mit der umfassenden Bewertungsmethode von Fromowitz durchgeführt [30]. Die Details der Antikörper sind in der Zusatzdatei 1: Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Proteine ​​aus menschlichen und Rattengeweben, HUASMCs, HTR-8/SVneo-Zellen und HUVECs in Western-Blot-Experimenten wurden mit mindestens drei Replikaten analysiert, wie zuvor beschrieben [31]. Die Details der Antikörper sind in der Zusatzdatei 1: Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Vollblutproben wurden aus Mutter- oder Nabelschnurblut von Menschen und Ratten entnommen. Die in den Seren zu untersuchenden Substanzen wurden mittels UV-Spektrophotometrie unter Verwendung von Nachweiskits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Mbbiology Biological, Jiangsu, China) gemessen. Die Kit-Details finden Sie in der Zusatzdatei 1: Ergänzungstabelle 3.

Biopsien aus Rattennieren (1 mm3) wurden 2–4 Stunden lang bei 4 °C fixiert, gewaschen und über Nacht bei 37 °C gelagert. Die fixierten Proben wurden dann für ultradünne Schnitte vorbereitet. Nach der Uran-Blei-Doppelfärbung wurden die Proben über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und die Bilder wurden gesammelt und unter einem Transmissionselektronenmikroskop (HT7700, Hitachi, Japan) analysiert.

Ein Annexin V-FITC-Apoptose-Kit (88-8005-72, Thermo Fisher, USA) wurde verwendet, um die Apoptoseraten von HUASMC- und HTR-8/SVneo-Zellen mittels Durchflusszytometrieanalyse zu bestimmen. Die Zellen wurden mit einem FACS-Durchflusszytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) analysiert. Die erfassten Daten wurden mit der FCS-Express-Software Version 3.0 (De Novo) analysiert.

Die Zellzyklusanalyse wurde auch mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Kurz gesagt, die Zellen wurden gesammelt und in PBS gewaschen, gefolgt von einer Fixierung in Ethanol (70 %). Nach einer Inkubation über Nacht bei –20 °C wurden die Zellen mit PI gefärbt und einer Durchflusszytometrie unterzogen. Anschließend wurde die Verteilung der Zellen in den Phasen G1, S und G2/M des Zellzyklus bestimmt.

Insgesamt 5 × 105 HTR-8/SVneo-Zellen oder HUVECs, denen über 48 Stunden Vehikel oder A2M-exprimierende Adenovirus-Vektoren verabreicht wurden, wurden in Platten mit 6 Vertiefungen ausgesät und gezüchtet, um konfluente Monoschichten zu erreichen. Dann wurde eine 2-μl-Pipettenspitze verwendet, um die Kratzer zu erzeugen. Die Bilder der migrierten Zellen wurden zwischen 0 und 36 Stunden aufgenommen. Der Prozentsatz des Wundverschlusses wurde analysiert.

Transfizierte Zellen (1 × 105 HTR-8/SVneo-Zellen oder HUVECs in 100 μl serumfreiem Medium) wurden in Transwell-Einsätze (8 μm Poren; Nr. 3422, Costar, Cambridge, MA, USA) ausgesät und der Rest Das Protokoll wurde zuvor beschrieben (32) (Hinweis: Den Zellen wurde 24 Stunden lang Serum entzogen, bevor sie von den Platten geerntet wurden).

HUVECs (5 × 104) wurden auf die Matrigel-beschichteten Vertiefungen von Platten mit 24 Vertiefungen ausplattiert und 6 Stunden lang inkubiert. HUVEC-Röhren wurden unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop (Nikon TE300, Japan) bewertet. Die Länge der geformten Rohre wurde analysiert. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt.

In allen unseren experimentellen Studien wurde jedes Experiment mindestens dreifach durchgeführt und es wurde eine verblindete Ergebnisbewertung implementiert. Die mittleren Variationskoeffizienten (CVs) für dreifache Werte wurden berechnet und dann auf der Grundlage dieser Werte ein großer mittlerer CV ermittelt. Die statistische Analyse wurde mit dem Statistikpaketprogramm SPSS 23.0 durchgeführt. Die Erstellung statistischer Diagramme wurde mit dem Softwarepaket GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, CA, USA) durchgeführt. T-Tests wurden verwendet, um die normalverteilten kontinuierlichen Variablen zu analysieren, und Mann-Whitney-U-Tests wurden verwendet, um die verzerrten Variablen zu analysieren (Daten waren normalverteilt). Alle Werte werden als Mittelwert ± SD oder Median (Interquartilbereich) dargestellt. Die Raten wurden mithilfe des exakten Fisher-Tests und des Chi-Quadrat-Tests nach Pearson verglichen, mit denen festgestellt werden sollte, ob es einen Unterschied zwischen den Kontroll- und den Versuchsdaten gab. P <0,05 wurde als signifikant angesehen [31, 33, 34]. Alle Statistikdaten zu Tierversuchen und der genaue Wert von n sind in der Zusatzdatei 1: Ergänzungstabelle 4 aufgeführt.

In dieser Studie wurden die Daten von 53 gesunden schwangeren Frauen und 52 schwangeren Frauen mit früh einsetzender LE statistisch analysiert, um ihre klinischen und Labormerkmale sowie unerwünschten Schwangerschaftsausgänge zu bewerten (Tabelle 2). Die Ergebnisse stimmen mit den Merkmalen von PE überein (Zusatzdatei 1: Ergänzendes Ergebnis 2). Mithilfe von ELISA und Immunfluoreszenzfärbung konnten wir zeigen, dass die A2M-Spiegel im mütterlichen Serum im zweiten und dritten Trimester bei PE-Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden signifikant erhöht waren, es jedoch keinen signifikanten Unterschied in der postnatalen Phase gab (Abb. 1a). Die Immunfluoreszenzfärbung von A2M und α-SMA zeigte, dass A2M überwiegend in der glatten Muskulatur der Spiralarterie in der menschlichen Decidua basalis exprimiert wurde (Abb. 1b, d), und dass in der uno eine signifikant höhere Expression von α-SMA und A2M vorlag -remodellierte Spiralarterien als in den umgestalteten Spiralarterien (Abb. 1c). Darüber hinaus entdeckten wir bei PE decidua basalis mehr nicht umgebaute Spiralarterien als bei normaler Schwangerschaft (Abb. 1d, d1). Darüber hinaus zeigte die Immunfluoreszenz-Doppelfärbung der Querschnitte der Spiralarterien eine signifikant höhere Expression von α-SMA und A2M in der PE-Gruppe im Vergleich zur normalen Gruppe (Abb. 1d, d2–d3), was durch Western-Blot-Daten bestätigt wurde aus der menschlichen Decidua basalis (Abb. 1e, e1–e2).

Beurteilung der A2M-Expression im mütterlichen und fetalen Teil der Plazenta. a Bestimmung der A2M-Spiegel im mütterlichen Serum aus dem ersten, zweiten und dritten Schwangerschaftstrimester sowie dem dritten Tag nach der Entbindung in der Normal- und PE-Gruppe mittels ELISA. b, c Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung von A2M und α-SMA in den Querschnitten der Spiralarterie aus der Decidua basalis des ersten Trimesters (gegengefärbt mit DAPI) (b), und c ist die quantitative Analyse des positiven Expressionsbereichs von α-SMA und A2M im Gesamtgefäß. d, d1–d3 Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung von α-SMA und A2M in den Querschnitten der Spiralarterie aus der Decidua basalis des dritten Trimesters (gegengefärbt mit DAPI) (d), d1 ist die Analyse des Verhältnisses von un- umgestaltete Blutgefäße pro Feld, und d2–d3 ist die quantitative Analyse des positiven Expressionsbereichs von α-SMA (d2) und A2M (d3) im gesamten Gefäß. e, e1–e2 Western-Blot-Daten, die die Expression von α-SMA und A2M in der Decidua basalis des dritten Trimesters zeigen (e), und e1–e2 sind die quantitative Analyse der Expression von α-SMA (e1) und A2M ( e2) in der Normal- und PE-Gruppe. f Bestimmung der A2M-Spiegel im Nabelschnurserum in der Normal- und PE-Gruppe mittels ELISA. g, g1 Western-Blot-Daten, die den A2M-Spiegel im Zottenchorion des dritten Trimesters zeigen (g), und g1 ist die quantitative Analyse der A2M-Expression in der Normal- und PE-Gruppe. h A2M-immunhistochemische Analyse von Querschnitten des Zottenchors im ersten oder dritten Trimester. i Repräsentative immunhistochemische HE- und CD31-Färbung auf Querschnitten des Zottenchors des dritten Trimesters aus der Normal- und PE-Gruppe. j, j1–j2 VEGF- und VEGFR2-immunhistochemische Färbung auf Querschnitten des Zottenchorions des dritten Trimesters aus der Normal- und PE-Gruppe (j) und j1–j2 zeigen die quantitative Analyse von VEGF (j1) und VEGFR2 (j2). Ausdruck in den beiden Gruppen. Maßstabsbalken = 100 μm in b und d; 20 μm in h–j. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Mittels ELISA und Western Blot haben wir gezeigt, dass die A2M-Spiegel im Nabelschnurserum und im Zottenchorion bei PE-Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden signifikant erhöht waren (Abb. 1f, g, g1) und dass A2M spezifisch im Gefäßendothel des Nabelschnurserums exprimiert wurde Zotten-Chorion in der menschlichen Plazenta, wie durch immunhistochemische Färbung von A2M nachgewiesen (Abb. 1h). Darüber hinaus wurden in Plazenten von PE-Patienten weniger Blutgefäße und kleinere Gefäßkapazitäten beobachtet als in Plazenten normaler Gruppen (Abb. 1i), während wir die signifikant verringerte Expression von VEGF und seinem Rezeptor VEGFR2 in der PE-Gruppe entdeckten (Abb. 1j, j1). –j2).

Die erfolgreiche Etablierung des A2M-Überexpressions-Rattenmodells (Abb. 2a) wurde durch die Daten aus ELISA (Abb. 2b) und Western Blot (Abb. 2c, d) bestätigt. Es gab signifikant erhöhte A2M-Spiegel im mütterlichen Serum und bei Ratten mit A2M-Überexpression am Gestationstag 19,5 (Abb. 2b) und eine verstärkte Expression von A2M-Protein in der A2M-Überexpressionsratte Decidua basalis (Abb. 2c, c1) und der Feto-Plazenta ( Abb. 2d, d1) im Vergleich zu denen der Kontrollratten (Vehikel).

Beurteilung des Blutdrucks sowie der Leber- und Nierenfunktionsindizes im A2M-Überexpressionsrattenmodell. a Schematische Darstellung der Etablierung eines humanisierten Modells trächtiger Ratten mit A2M-Überexpression. b Bestimmung der A2M-Spiegel in den Seren trächtiger Ratten während verschiedener Schwangerschaftsstadien (GD7.5 und GD19.5) in der Kontroll- und A2M-Überexpressionsgruppe mittels ELISA. c, d, c1–dI Western-Blot-Daten, die den A2M-Spiegel in der Decidua basalis (c) und der feto-Plazenta (d) zeigen, und c1–d1 sind die quantitative Analyse der A2M-Expression bei Kontroll- und A2M-Überexpressionsratten. e–h Die Trends in der Variation des systolischen (e, g) oder diastolischen (f, h) Drucks der Kontroll- und A2M-überexprimierenden Gruppen sowohl bei nicht trächtigen (e, f) als auch bei trächtigen (g, h) Ratten. i, j Repräsentative TEM-Bilder der Nieren beider Gruppen. k–o Repräsentative HE-Färbung (k–l) und PAS-Färbung (m, n) von Querschnitten von Rattennieren aus der Kontroll- und A2M-Überexpressionsgruppe, und o zeigt die quantitative Analyse der Fläche des Bowman-Raums aus beiden Gruppen . p Urinproteinspiegel (mg/24 h) bei GD7,5 und GD19,5 von den Kontroll- und A2M-Überexpressionsratten. q–u Bestimmung der Konzentrationen von BUN (q), CREA (r), UA (s), ALT (t) und AST (u) in Rattenseren der Kontroll- und A2M-Überexpressionsgruppen. Maßstabsbalken = 5 μm in i, j; 50 μm in k–n. Abkürzungen: TEM, Transmissionselektronenmikroskop; Enc, Endothelzelle; Podo, Podozyten; Kappe, Kapillare; BUN, Blut-Harnstoff-Stickstoff; CREA, Kreatinin; UA, Harnsäure; ALT, Alanin-Aminotransferase; AST, Aspartataminotransferase. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Um zu beurteilen, ob die Manifestationen des A2M-überexprimierenden Rattenmodells mit den klinischen Manifestationen von PE übereinstimmen, haben wir zunächst dynamisch den Blutdruck von Ratten gemessen, denen entweder Vehikel oder A2M-exprimierende Adenovirusvektoren verabreicht wurden. Die Ergebnisse zeigten keine Veränderungen des Blutdrucks bei nicht trächtigen Ratten nach der A2M-Verabreichung (Abb. 2e, f), aber sowohl der systolische als auch der diastolische Druck waren bei Ratten, denen A2M verabreicht wurde, innerhalb einer Woche nach der A2M-Verabreichung signifikant, aber allmählich erhöht (Abb. 2g, h). TEM-Bilder des Glomerulus der Ratte zeigten deutlich, dass die Überexpression von A2M ultrastrukturelle Schäden am Glomerulus verursachte, wie z. B. Ödeme, kollabiertes Gefäßlumen und Endothelhyperplasie (Abb. 2i, j). Die HE- und PAS-Färbung zeigte, dass die Überexpression von A2M im Vergleich zur Kontrolle tatsächlich zu einer Zunahme der Infiltration entzündlicher Zellen und sogar zu morphologischen Schäden im Glomerulus, wie z. B. einer schmaleren Bowman-Kapsel, führte (Abb. 2k – o). Die 24-Stunden-Urinproteinmessung wurde mithilfe eines BCA-Proteinassays durchgeführt und die Ergebnisse zeigten einen signifikanten Anstieg der A2M-Überexpressionsratten im Vergleich zu den Kontrollratten am 19.5. Gestationstag (Abb. 2p). Die ELISA-Ergebnisse zeigten einen signifikanten Anstieg der BUN- und CREA-Spiegel, aber keine signifikanten Veränderungen der ALT-, AST- und UA-Spiegel im mit A2M verabreichten Rattenserum im Vergleich zum Kontrollrattenserum (Abb. 2q – u). Darüber hinaus führte die mütterliche A2M-Überexpression zu einer Einschränkung des fötalen Wachstums (z. B. weniger und kleinere Föten und Plazentagröße) (Zusatzdatei 1: Abb. S1).

Da A2M in der glatten Gefäßmuskulatur schwangerer Frauen mit früh einsetzender Lungenembolie stark exprimiert wird, haben wir vernünftigerweise die Hypothese aufgestellt, dass die Lungenembolie durch einen deutlich fehlerhaften Umbau der Uterusspiralarterie verursacht wurde [35], der weiter zu einem erhöhten Plazentagefäßwiderstand führte [36] (Abb . 3a). Daher haben wir eine Reihe von Gefäßwiderstandsindizes [37] bei schwangeren Frauen untersucht (Abb. 3b – g). Die Ergebnisse zeigten, dass der Nabelschnur-PI (Abb. 3b) und der RI (Abb. 3c) im zweiten und dritten Schwangerschaftstrimester bei Frauen mit LE im Vergleich zu gesunden Frauen signifikant erhöht waren und dass es zu einem signifikanten Anstieg der Pulsatilität der linken Uterusarterie kam Index (Lt ut-PI) (Abb. 3d), der Pulsatilitätsindex der rechten Gebärmutterarterie (Rt ut-PI) (Abb. 3e), der Widerstandsindex der linken Gebärmutterarterie (Lt ut-RI) (Abb. 3f) und der rechte Uterusarterien-Widerstandsindex (Rt ut-RI) (Abb. 3g) bei schwangeren Frauen mit PE im Vergleich zu gesunden schwangeren Frauen. Darüber hinaus zeigte die Ultraschalluntersuchung trächtiger Ratten (Abb. 3h), dass die Überexpression von A2M Lt ut-PI (Abb. 3h1) und Lt ut-RI (Abb. 3h2) im Vergleich zur Kontrolle signifikant steigerte. Die Immunhistochemie zeigte eine verstärkte Expression von α-SMA in der Spiralarterie und mehr nicht umgebaute Spiralarterien bei Ratten mit A2M-Überexpression (Abb. 3i, i1 – i2). Ähnliche Ergebnisse wurden für die α-SMA-Expression durch Western Blot erhalten (Abb. 3j).

Bewertung des Index der Spiralarterienumgestaltung bei schwangeren Frauen und A2M-Überexpressionsratten. a Schematische Darstellung der Etablierung einer PE aufgrund eines fehlgeschlagenen Umbaus der Spiralarterie. b, c Bestimmung der Werte von PI (b) und RI (c) der Nabelarterie in der Normal- und PE-Gruppe während des zweiten und dritten Schwangerschaftstrimesters. d–g Bestimmung der Werte von Lt ut-PI (d), Rt ut-PI (e), Lt ut-RI (f) und Rt ut-RI (g) in der Normal- und PE-Gruppe während der ersten, sekundäres und drittes Schwangerschaftstrimester. h, h1–h2 Repräsentative Ultraschalluntersuchung der Uterusspiralarterie von Ratten von Kontroll- und A2M-Überexpressionsratten (h) und h1–h2 zeigen die quantitative Analyse von Lt ut-PI (h1) und Lt ut-RI (h2) aus dem Obigen Gruppen. i, i1–i2 α-SMA-immunhistochemische Analyse von Querschnitten von Spiralarterien aus der Kontroll- und der A2M-Überexpressionsgruppe (i). i1 ist die quantitative Analyse der α-SMA-Expression und i2 ist das Verhältnis der nicht umgestalteten Spiralarterien pro Feld in den beiden Gruppen. j, j1 Western-Blot-Daten, die den α-SMA-Spiegel in der Decidua basalis (j) zeigen, und j1 sind die quantitative Analyse der α-SMA-Expression in der Kontroll- und A2M-überexprimierenden Gruppe. Maßstabsbalken = 100 μm in i. Abkürzungen: PI, Pulsatilitätsindex; RI, Widerstandsindex; Lt ut, linke Gebärmutterarterie; Rt ut, rechte Gebärmutterarterie. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Wir untersuchten die Wirkung der A2M-Expression auf die Proliferation und Apoptose der glatten Muskelzellen der Uterusspiralarterie, indem wir die A2M-Expression in HUASMCs manipulierten. Der CCK8-Assay (Abb. 4a) und das Western Blot (Abb. 4b, b1–b2) zeigten, dass die Zellproliferation in der A2M-Überexpressionsgruppe dramatisch zunahm und in der A2M-herunterregulierten Gruppe abnahm. Die Analyse der Durchflusszytometrie zeigte, dass die Unterdrückung der A2M-Expression in HUASMCs keinen Einfluss auf das Fortschreiten des Zellzyklus oder die Apoptose hatte, die Überexpression von A2M jedoch zu einem Stillstand des Zellzyklus in der S-Phase (Abb. 4c – f) und einer Unterdrückung der Zellapoptose führte (Abb. 4g – j). . Experimente an menschlichen Proben bestätigten die Beobachtung wie folgt. Die doppelte Immunfluoreszenzfärbung von α-SMA und PCNA zeigte eine erhöhte Anzahl PCNA-positiver Zellen in der Decidua basalis menschlicher Patienten mit PE (Abb. 4k, k1), und ähnliche Ergebnisse wurden für die PCNA-Expression durch Western Blot erhalten (Abb. 4l). . Darüber hinaus zeigte die Western-Blot-Analyse, dass die FAS-Expression in der Decidua basalis von PE-Patienten verringert war (Abb. 4m).

Bewertung der Proliferation und Apoptose in glatten Muskelzellen der menschlichen Nabelarterie (HUASMCs) nach Manipulation der A2M-Expression und der menschlichen Decidua basalis. a, b, b1–b2 Bestimmung der HUASMC-Lebensfähigkeit in der Kontroll-, A2M-Überexpressions- und A2M-herunterregulierten Gruppe nach 12-, 24-, 48-, 72- und 96-stündiger Inkubation durch CCK-8-Assay (a). Western-Blot-Daten, die die Expression von A2M und α-SMA in HUASMCs (b) und b1–b2 zeigen, zeigen die quantitative Analyse der Expression von A2M (b1) und α-SMA (b2) in der Kontrolle, A2M-Überexpression und A2M- herunterregulierte Gruppen. c–f Durchflusszytometriedaten, die die Analyse des DNA-Gehalts in HUASMCs zeigen, die mit der Negativkontrolle (Kontrolle) (c), dem A2M-Silencing-Vektor (A2Msi) (d) oder dem A2M-überexprimierenden Vektor (A2M) (e) transfiziert wurden f zeigt die quantitative Analyse des Zellanteils in jeder Phase des Zellzyklus in den drei Gruppen. g–j Die Apoptose von HUASMCs, die mit Negativkontrolle (Kontrolle) (g), A2M-Silencing-Vektoren (h) oder A2M-Überexpressionsvektor (i) transfiziert wurden, wurde durch Durchflusszytometrie unter Verwendung des Annexin V-FITC/PI-Apoptose-Assays bestimmt j zeigt die quantitative Analyse der Zellapoptoseraten in den drei Gruppen. k, k1 Repräsentative doppelte Immunfluoreszenzfärbung von α-SMA und PCNA auf den Querschnitten der Spiralarterien (gegengefärbt mit DAPI) des dritten Trimesters aus der Normal- und PE-Gruppe, und k1 zeigt die quantitative Analyse der PCNA-Expression in beiden Gruppen . l, m Western-Blot-Daten, die die Expression von PCNA (l) und FAS (m) und die quantitative Analyse der menschlichen Decidua basalis des dritten Trimesters aus der Normal- und PE-Gruppe zeigen. Maßstabsbalken = 50 μm in k. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Um die Auswirkungen von EVTs auf den Umbau der Uterusspiralarterie [38, 39] im Zusammenhang mit der A2M-Überexpression zu bestimmen, wurden Wundheilungs- und Transwell-Invasionstests verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass die A2M-Überexpression die Migrations- und invasiven Fähigkeiten von HTR-8 signifikant unterdrückte /SVneo-Zellen (Zusatzdatei 1: Abb. S2). Wir fanden auch heraus, dass die Proliferation von Trophoblastenzellen verringert und die Zellapoptose im Zusammenhang mit der A2M-Überexpression verstärkt war (zusätzliche Datei 1: Abb. S3).

Western Blot zeigte, dass die Überexpression von A2M die Expression von PCNA und p-Smad2/3 verstärkte, während die Herunterregulierung von A2M die Expression beider Gene in HUASMCs unterdrückte (Abb. 5a, a1 – a4); Darüber hinaus erhöhte die Zugabe von TGFβ1 die A2M-, PCNA- und p-Smad2/3-Expression signifikant (Abb. 5b, b1–b4). Western-Blot-Daten zeigten, dass die TGFβ1-Expression in der Decidua basalis von Patienten mit PE im Vergleich zu normalen schwangeren Frauen erhöht war (Abb. 5c).

Bewertung der Proliferation und der TGFβ-Signalisierung in glatten Muskelzellen nach Manipulation der A2M-Expression und der menschlichen Decidua basalis. a, a1–a4 Western-Blot-Daten, die die Expression von A2M, p-Smad2/3, TGFβ1 und PCNA in HUASMCs zeigen, die mit Negativkontroll-, A2M-Überexpressions- oder A2M-Silencing-Vektoren (a) transfiziert wurden, und a1–a4 zeigen die quantitative Analyse von A2M (a1), p-Smad2/3 (a2), TGFβ1 (a3) ​​und PCNA (a4) in der Kontrollgruppe, der A2M-Überexpressionsgruppe und der A2M-herunterregulierten Gruppe. b, b1–b4 Western-Blot-Daten, die die Expression von A2M, p-Smad2/3, TGFβ1 und PCNA in HUASMCs zeigen, die mit Negativkontrolle transfiziert, mit TGFβ1 behandelt und A2M-stummgeschaltet + mit TGFβ1 behandelt wurden (b) und b1–b4 zeigen die quantitative Analyse der A2M- (b1), p-Smad2/3- (b2), TGFβ1- (b3) und PCNA- (b4) Expressionen in den Kontroll-, Behandlungs- mit TGFβ1- und A2M-stummgeschalteten + mit TGFβ1-behandelten Gruppen. c Western-Blot-Daten, die die Expression von TGFβ1 und die quantitative Analyse der TGFβ1-Expression in menschlichen Decidua basalis des dritten Trimesters aus der Normal- und PE-Gruppe zeigen. d Schematische Darstellung der A2M-Überexpression, die zur Zellproliferation über den TGFβ-Signalweg führt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Die PAS-Färbung zeigte, dass das Verhältnis der Labyrinthgröße zur Gesamtplazentagröße bei Ratten mit A2M-Überexpression kleiner war als bei Kontrollratten (Abb. 6a, a1). Die HE-Färbung zeigte, dass die Fläche der Blutsinusoide in der Labyrinthschicht von Ratten mit A2M-Überexpression im Vergleich zur Kontrolle verringert war (Abb. 6a, a2). Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte die erhöhte A2M- und verringerte Caveolin1-Expression im Labyrinth der A2M-überexprimierenden Ratten im Vergleich zu Kontrollratten (Abb. 6b, b1 – b2). Diese Ergebnisse wurden durch Western-Blot-Daten aus dem Rattenlabyrinth bestätigt (Abb. 6c, d, c1 – d1). Darüber hinaus zeigte das Western Blot, dass die VEGF- und CD31-Expression im Plazentalabyrinth mit A2M-Überexpression signifikant höher war als in der Kontrolle (Abb. 6e, f, e1 – f1).

Bewertung der feto-plazentaren Angiogenese im A2M-Überexpressionsrattenmodell. a, a1–a2 Repräsentative PAS- und HE-Färbung (a) auf den Querschnitten von Rattenplazenta aus der Kontroll- und A2M-Überexpressionsgruppe, und a1–a2 sind die quantitative Analyse der Fläche der Plazenta-Labyrinthzone (a1) und der Bereich des plazentaren Blutsinusoids (a2) aus der Kontroll- und der A2M-Überexpressionsgruppe. b, b1–b2 Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung von A2M und Caveolin1 in den Querschnitten von Rattenplazenta aus der Kontroll- und A2M-Überexpressionsgruppe (b), und b1–b2 sind die quantitative Analyse positiver Bereiche der A2M- und Caveolin1-Expression (% ). c–f, c1–f1 Western-Blot-Daten, die die Expression von A2M (c), Caveolin1 (d), VEGF (e) und CD31 (f) in der plazentaren Labyrinthzone der Kontroll- und A2M-Überexpressionsgruppen zeigen. c1–f1 zeigt die quantitative Analyse der Expression von A2M (c1), Caveolin1 (d1), VEGF (e1) und CD31 (f1) aus der Kontroll- und der A2M-Überexpressionsgruppe. Maßstabsbalken = 2 mm im oberen Feld von a; 100 μm im unteren Bereich von a; 50 μm in b. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Als nächstes wurden Wundheilungs- und Transwell-Migrationstests verwendet, um die Migrations- und Invasionsfähigkeiten von HUVECs zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl die Wundverschlussrate (Abb. 7a, a1) als auch die Anzahl der HUVECs, die zur unteren Seite der Membran wanderten (Abb. 7b, b1), in A2M-Überexpressionsgruppen im Vergleich zu Kontrollgruppen signifikant abnahmen. Filopodien beeinflussen die Zellmigration, wie in Abb. 7c dargestellt. Die F-Actin-Färbung in HUVECs zeigte die verringerte Länge und Anzahl von Filopodien in HUVECs mit A2M-Überexpression im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 1c, c1 – c2). Darüber hinaus verringerte die Überexpression von A2M in HUVECs die ZO-1-Expression signifikant (Abb. 7d, d1) und unterdrückte die Bildung von HUVEC-Röhren signifikant (Abb. 7e, e1), was auf eine Hemmung der Fähigkeit zur Migration von Epithelzellen schließen lässt.

Beurteilung der Zellmigration und Röhrenbildung von HUVECs nach Manipulation der A2M-Expression. a, a1 Repräsentative Bilder von Wundheilungstests von HUVECs nach 24 Stunden aus Negativkontrolle (Kontrolle) oder A2M-Überexpressionsgruppen (a), und a1 zeigt die quantitative Analyse der relativen Zellmigration in beiden Gruppen. b, b1 Repräsentative Bilder von Transwell-Migrationstests von HUVECs, die nach 24-stündiger Inkubation entweder mit Negativkontrolle oder A2M-Überexpressionsvektoren transfiziert wurden (b), und b1 zeigt die quantitative Analyse der Anzahl migrierter Zellen in beiden Gruppen. c, c1–c2 Repräsentative Fluoreszenzfärbung und stark vergrößerte Bilder von F-Aktin auf der Negativkontrolle oder A2M-Überexpressions-HUVECs (c) und c1–c2 zeigen die quantitative Analyse der Anzahl (c1) und Länge (c2) von Filopodien jeder Zelle in beiden Gruppen. d, d1 Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung von ZO-1 auf der Negativkontrolle oder A2M-Überexpressions-HUVECs (d), und d1 zeigt die quantitative Analyse der relativen ZO-1-Fluoreszenzintensität (% der Kontrolle) in beiden Gruppen. e, e1 Repräsentative Bilder von Röhrchenbildungstests von HUVECs nach 6- und 24-stündiger Inkubation aus Negativkontroll- oder A2M-Überexpressionsgruppen, und e1 zeigt die quantitative Analyse der gesamten Röhrchenlänge (% der Kontrolle) bei 6-stündiger Inkubation in beiden Gruppen. Maßstabsbalken = 200 μm in a und e; 50 μm in b und d; 20 μm in c. **P < 0,01, ***P < 0,001

Western Blot zeigte eine hohe HIF-1α-Expression in HUASMCs mit A2M-Überexpression, jedoch keine Änderung der HIF-1α-Expression, wenn A2M herunterreguliert wurde (Abb. 8b – b1). Diese Ergebnisse legen nahe, dass ein fehlerhafter Umbau der Spiralarterie sowie eine fehlerhafte Plazenta-Angiogenese eine Ischämie verursachen, die die hohe Expression von HIF-1α weiter induziert. Bemerkenswerterweise stellten wir fest, dass der sFLT-1-Spiegel in der PE-Gruppe im Vergleich zu der normalen Gruppe während der verschiedenen Stadien der Schwangerschaft signifikant höher und der PIGF-Spiegel signifikant verringert war (Abb. 8c, d). Es gab eine negative Korrelation zwischen PIGF und A2M (R = –0,768, P <0,001) und eine positive Korrelation zwischen sFLT-1 und A2M (R = 0,659, P <0,001) im mütterlichen Plasma der Präeklampsie-Frauen (zusätzliche Datei). 1: Abb. S4). Im A2M-Überexpressionsrattenmodell stiegen die sFLT-1-Spiegel an (Abb. 8e) und die PIGF-Spiegel sanken (Abb. 8f), was in den Seren von A2M-Überexpressionsratten im Vergleich zu den Kontrollratten am 19,5. Trächtigkeitstag signifikant war.

Messung der HIF-1α- und sFIt-1/PIGF-Spiegel im mütterlichen Serum und in A2M-manipulierten HUASMCs. a Schematische Darstellung einer unangemessenen Umgestaltung der Spiralarterie und einer abnormalen Plazenta-Angiogenese bei Vorliegen einer A2M-Überexpression. b, b1 Western-Blot-Daten, die die Expression von HIF-1α in der Kontrollgruppe, der A2M-Überexpressionsgruppe und der A2M-herunterregulierten Gruppe (b) zeigen, und b1 zeigt die quantitative Analyse der HIF-1α-Expression in den drei Gruppen. c, d ELISA-Daten, die die sFLT-1- (c) und PIGF-Spiegel (d) im humanen mütterlichen Serum aus dem ersten, zweiten und dritten Schwangerschaftstrimester in der Normal- und PE-Gruppe zeigen. e, f ELISA-Daten, die die sFLT-1- (e) und PIGF-(f)-Spiegel im mütterlichen Rattenserum bei GD7,5 und GD19,5 in der Kontroll- und A2M-Überexpressionsgruppe zeigen. *P < 0,05, ***P < 0,001

Eine frühere Studie zeigte, dass bei gesunden schwangeren Frauen tatsächlich eine leichte systemische Entzündung auftrat und sich der Status bei PE verschlechterte [40]. In der vorliegenden Studie haben wir berichtet, dass ein erhöhter A2M-Spiegel am Auftreten einer früh einsetzenden Präeklampsie beteiligt war, da er sich negativ auf den Umbau der Uterusspiralarterien und die Plazenta-Angiogenese auswirkte (Abb. 9). Da A2M endogene/exogene entzündliche Verletzungen reduzieren kann, wurde es bei einer Vielzahl von Behandlungen orthopädischer Schmerzen wie subakromialer Bursitis, lateraler Epicondylitis und Achillessehnenentzündung eingesetzt [41]. A2M wird auch verwendet, um den Entzündungsstatus bei degenerativen Erkrankungen, Erkrankungen des Immunsystems, des Verdauungssystems und des Harnsystems zu ermitteln [42,43,44,45]. In dieser Studie haben wir ein Ungleichgewicht zwischen entzündungsfördernden und entzündungshemmenden Zytokinen in der Schwangerschaft mit PE festgestellt (Zusatzdatei 1: Abb. S5), was die Möglichkeit impliziert, dass A2M an der Entwicklung von PE während der Schwangerschaft beteiligt ist. Als einzigartiger Proteinase-Inhibitor entfernt A2M proinflammatorische Zytokine bei PE nicht vollständig, während erhöhtes A2M für den PE-ähnlichen Phänotyp verantwortlich sein kann, was darauf hindeutet, dass A2M eine zweischneidige Rolle bei der Entwicklung von PE spielen könnte [46] .

Ein vorgeschlagenes Modell, das die zugrunde liegende Annahme für die Rolle von A2M bei der Entwicklung von PE zeigt. Der vorgeschlagene Mechanismus, durch den A2M über seinen negativen Einfluss auf den Umbau der Uterusspiralarterie und die Angiogenese der Plazenta am Auftreten von PE beteiligt ist

Sowohl die Veränderung der Uterusspiralarterien als auch die Angiogenese der Plazenta sind entscheidende Ereignisse, die für eine ausreichende Blutversorgung sorgen, um die Plazenta vollständig zu durchbluten und so den Anforderungen des wachsenden Fötus während der Schwangerschaft gerecht zu werden [47, 48]. Wenn die Modifikationen aus irgendeinem Grund unterbrochen würden, hätte dies daher eine unzureichende Modifikation der Spiralarterien und eine fehlerhafte Plazenta-Angiogenese zur Folge, was das Risiko des PE-Szenarios erheblich erhöhen könnte [49]. Daher untersuchten wir in dieser Studie die möglichen Auswirkungen einer A2M-Überexpression auf beide Ereignisse bei der Entwicklung von PE während der Schwangerschaft.

Unsere klinische Schwangerschaftskohortenstudie zeigte, dass A2M ab dem dritten Schwangerschaftstrimester überwiegend in der Spiralarterie exprimiert wurde, was der Expression von α-SMA ähnelt; Die A2M-Spiegel in den Seren schwangerer Frauen mit früh einsetzender PE waren im zweiten und dritten Schwangerschaftstrimester signifikant erhöht, und ähnliche Ergebnisse wurden in der menschlichen Uterus-Decidua basalis beobachtet (Abb. 1a–e), was auf das Auftreten von PE hinwies unzureichende Umgestaltung der Uterusspiralarterie. Mit anderen Worten: Die Überexpression von A2M könnte eng mit der Pathophysiologie der PE verbunden sein, indem sie sich negativ auf den Umbau der Uterusspiralarterie auswirkt. Wir vermuteten, dass A2M verwandte Proteasen, Zytokine und Wachstumsfaktoren hemmt [50], was sich auf das Überleben und die physiologischen Funktionen glatter Muskelzellen während des Umbaus der Spiralarterie auswirken würde. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Überexpression von A2M im Gefäßbett der Plazenta die Angiogenese der Plazenta drastisch einschränkte (Abb. 1f – j); Daher ist die abnormale Vaskularisierung der Plazentazotten offensichtlich ein Schlüsselfaktor, der nicht vernachlässigt werden darf. Es sollte beachtet werden, dass A2M Berichten zufolge an Atherosklerose beteiligt ist, indem es die Lipogenese glatter Gefäßmuskelzellen erleichtert [51], was auf einen möglichen pathologischen Mechanismus bei PE, d. h. eine ähnliche Gefäßläsion in der Schwangerschaft, schließen lässt.

Eine Überexpression von A2M wurde bei nicht trächtigen und trächtigen Ratten festgestellt (Abb. 2), um die Möglichkeit einer A2M-Beteiligung an PE zu untersuchen. Die unterschiedlichen Blutdruckreaktionen auf die A2M-Überexpression zwischen nicht trächtigen und trächtigen Ratten deuteten insbesondere darauf hin, dass der durch die A2M-Überexpression induzierte erhöhte Blutdruck mit einer Schwangerschaft verbunden war (Abb. 2e – h). Darüber hinaus wurden die folgenden Phänotypen beobachtet: morphologische Veränderungen in den Rattennieren und Proteinurie bei den Ratten, die zweifellos zum Auftreten von PE bei Ratten mit A2M-Überexpression beitrugen (Abb. 2i – u) sowie eine Einschränkung des intrauterinen Wachstums und eine schlechte Plazentation (Zusatzdatei 1: Abb. S1), die extrem mit den Diagnoseindizes der LE übereinstimmten [52, 53]. Darüber hinaus unterdrückte die Überexpression von A2M auch die Plazentavaskularisierung stark (Abb. 6). All diese Daten veranlassten uns, den kausalen Zusammenhang zwischen A2M-Überexpression und PE weiter zu untersuchen.

In Bezug auf den Umbau der Uterusspiralarterie [54] stellten wir fest, dass die Überexpression von A2M die Proliferation von HUASMC-Zellen förderte und die Apoptose von HUASMC-Zellen hemmte (Abb. 4a–j), was darauf hindeutet, dass der normale Ersatz von Uterusspiralendothelzellen und glatten Muskelzellen in diesem Zusammenhang eingeschränkt war der A2M-Überexpression. Mit anderen Worten: Eine Überexpression von A2M könnte die Kaskadenregulation am normalerweise fortschreitenden Abbau der Endothel- und glatten Muskelzellen in den Uterusspiralarterien hindern und dadurch das Risiko einer PE erhöhen. Andererseits wurden die Merkmale von Trophoblastenzellen, die durch das A2M-Gen überexprimiert werden, bewertet, da die Migration und Invasion von Trophoblastenzellen eine sehr wichtige Rolle bei der Umgestaltung der Uterusspiralarterie spielt [55, 56]. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass sowohl Migrations- als auch invasive Fähigkeiten sowie Apoptose und Proliferation von Trophoblastzellen durch eine erhöhte A2M-Expression dramatisch beeinträchtigt wurden (Zusatzdatei 1: Abb. S2-S3), was darauf hindeutet, dass EVTs fötalen Ursprungs durch beeinflusst werden könnten überlastete A2M durch einen unklaren Mechanismus. Um die oben genannten Phänotypen weiter zu untersuchen, haben wir die TGFβ-Signalübertragung nach der A2M-Genmanipulation untersucht, da bekannt ist, dass die TGFβ-Superfamilie die Reaktionen von Gefäßendothelzellen und glatten Muskelzellen während der Gefäßumgestaltung sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen reguliert (57). Wie erwartet zeigten unsere experimentellen Beweise (Abb. 5a, b) eindeutig einen kausalen Zusammenhang zwischen der A2M-Genexpression und der Aktivierung des TGFβ-Signals, d Die oben beschriebene Spiralarterie führt dann zu einem ungeeigneten Gefäßumbau. Dieser Befund ist gut belegt und wird durch die Tatsache bestätigt, dass TGFβ1 in den glatten Muskeln der Uterusspiralarterie schwangerer Frauen mit früh einsetzender PE stark exprimiert wurde (Abb. 5c).

Andererseits beeinflusste die Überexpression von A2M die Plazentavaskularisierung, wie z. B. die Aortenstenose des Plazentalabyrinths und die verringerte Expression spezifischer Endothelmarker (Caveolin1, CD31) und VEGF (Abb. 6). Angiogenese ist an der Zellproliferation, Migration, Adhäsion und Röhrenbildung beteiligt [58]. In dieser Studie hemmte die Überexpression von A2M eindeutig die HUVEC-Migration, wahrscheinlich durch Hemmung der Bildung endothelialer Filopodien und Zell-Zell-Verbindungen sowie der Röhrenbildung (Abb. 7a – e). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Überexpression von A2M zu einer Behinderung der Plazentavaskularisierung führte, die das Auftreten von PE hervorrufen oder verschlimmern würde.

Als auslösendes Ereignis bei früh einsetzender PE werden üblicherweise Plazentaischämie und Hypoxie angesehen, die wiederum zur Freisetzung verschiedener Faktoren plazentaren Ursprungs führen und schließlich den mütterlichen Blutdruck während der Schwangerschaft beeinflussen [59,60,61]. Die durch A2M induzierte übermäßige Proliferation glatter Muskelzellen verschlimmerte den unangemessenen Gefäßumbau sowie eine fehlerhafte Plazenta-Vaskularisierung, die entscheidende Faktoren für Plazenta-Ischämie und Hypoxie sein können. Insbesondere wurde nachgewiesen, dass Ischämie und Anoxie eng mit dem Ausmaß der A2M-Genexpression verbunden sind (Abb. 8b). In ähnlicher Weise beobachteten wir im zweiten und/oder dritten Schwangerschaftstrimester einen signifikanten Anstieg der sFLT-1-Spiegel und einen Rückgang der PIGF-Spiegel im PE-Patientenserum (Abb. 8c, d), und die sFLT-1- und PIGF-Spiegel waren eng miteinander verbunden mit dem A2M-Spiegel im mütterlichen Plasma der Präeklampsie-Frauen (Zusatzdatei 1: Abb. S4). Darüber hinaus wurde bei Ratten mit A2M-Überexpression deutlich ein ähnlicher Trend der Veränderung der sFLT-1- und PIGF-Spiegel in den Seren trächtiger Ratten beobachtet (Abb. 8e, f). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Überexpression von A2M an der Freisetzung dieser Faktoren plazentaren Ursprungs im Zusammenhang mit einer verschlimmerten plazentaren Ischämie/Hypoxie beteiligt ist.

Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung einer ausreichenden uteroplazentaren Zirkulation in einer normalen Schwangerschaft sowie bei der Entwicklung einer PE (62, 63). Darüber hinaus wurden Angiotensin-II-Typ-1-Rezeptor-agonistische Autoantikörper (AT1-AAs) erstmals bei Frauen mit PE entdeckt und können den Angiotensin-II-Typ-1-Rezeptor als Reaktion auf Plazenta-Ischämie aktivieren und dadurch die Vasokonstriktion des Plazentagefäßsystems verstärken [64]. In dieser Studie zeigten viele Komponenten der RAAS und AT1-AAs abnormale Ausdrücke in PE (Zusatzdatei 1: Abb. S6-S8). Daher könnte eine Dysregulation des RAAS als Folgemechanismus der PE im Zusammenhang mit der A2M-Überexpression fungieren.

Zusammenfassend zeigten unsere Daten deutlich, wie A2M an der Pathophysiologie der PE beteiligt war. Kurz gesagt, A2M wird vorwiegend in der glatten Gefäßmuskulatur der Spiralarterie und im feto-plazentaren Gefäßsystem exprimiert und sein Spiegel ist unter dem Einfluss von aktiviertem TGFβ1 im Zusammenhang mit PE erhöht; Die hohe Expression führt wiederum zu einer übermäßigen Proliferation und verringerten Apoptose der glatten Gefäßmuskelzellen in der Uterusspiralarterie sowie zu einer unzureichenden Trophoblastenmigration und -invasion (d. h. zu einer unangemessenen Umgestaltung der Uterusspiralarterie). Unterdessen schränkt das überexprimierte A2M in den Plazentazotten auch die Angiogenese der Plazenta stark ein. Die beiden umfassenden Ergebnisse verschlimmern die plazentare Ischämie/Hypoxie und verändern die Freisetzung von sFLT-1 und PIGF aus der Plazenta, was zum Auftreten von mütterlichem Bluthochdruck, Proteinurie und fetaler Wachstumsbeschränkung, d. h. PE, führt. Darüber hinaus weist diese Arbeit mehrere Einschränkungen auf, wie z. B. das Fehlen präziser molekularer Mechanismen, die der A2M-Beteiligung am PE-Verlauf zugrunde liegen, eine geringe Anzahl von PE- und Kontrollproben und das Fehlen prospektiver Studien. Schließlich ist es wichtig, stärker integrierte Experimente zu entwerfen, um den pathophysiologischen Mechanismus, der PE zugrunde liegt, vollständig zu untersuchen. Wenn ja, können wir davon ausgehen, dass A2M in Zukunft ein potenzieller Biomarker und therapeutisches Ziel für PE sein wird.

Die Datenfreigabe ist für diesen Artikel nicht anwendbar, da während der aktuellen Studie keine Datensätze generiert oder analysiert wurden.

Alpha-2-Makroglobulin

Angiotensin II

Angiotensin-II-Typ-1-Rezeptor-agonistischer Autoantikörper

AT1R-Autoantikörper

Grundlegender Fibroblasten-Wachstumsfaktor

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Extravillöse Zytotrophoblasten

Hämatoxylin und Eosin

Glatte Muskelzellen der menschlichen Nabelarterie

Menschliche Endothelzellen der Nabelschnurvene

Pulsatilitätsindex der linken Gebärmutterarterie

Widerstandsindex der linken Gebärmutterarterie

Periodische Säure Schiff

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

Präeklampsie

Proteinkinase Cβ

Plazenta-Wachstumsfaktor

Renin-Angiotensin-Aldosteron-System

Widerstandsindex der rechten Gebärmutterarterie

Lösliche FMS-ähnliche Tyrosinkinase-1

Transformierender Wachstumsfaktor β1

Natürlicher Uteruskiller

Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor

Glatte Gefäßmuskelzellen

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Ich möchte den Geburtshelfern des ersten angeschlossenen Krankenhauses der Jinan-Universität für ihre Unterstützung und Unterstützung bei dieser Studie danken und allen schwangeren Frauen danken, die an dieser Studie teilgenommen haben.

Diese Studie wurde vom Science and Technology Planning Project der Provinz Guangdong in China (Nr. 2022A1515012139), dem Clinical Frontier Technology Program des First Affiliated Hospital der Jinan University, China (Nr. JNU1AF-CFTP-2022-a01209) und NSFC unterstützt Zuschuss (31971108, 32170825 und 31771331). Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung oder -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.

Jingyun Wang, Ping Zhang und Mengyuan Liu haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe, The First Affiliate Hospital of Jinan University, Jinan University, No.613 Huangpu Road West, Guangzhou, 510632, China

Jingyun Wang, Ping Zhang, Mengyuan Liu, Zhengrui Huang, Xiaofeng Yang, Yuzhen Ding, Jia Liu, Fengxiang Zhang und Ruiman Li

Internationales gemeinsames Labor für Embryonalentwicklung und pränatale Medizin, Abteilung für Histologie und Embryologie, Medizinische Hochschule, Jinan-Universität, Guangzhou, 510632, China

Jingyun Wang, Ping Zhang, Zhengrui Huang, Xiaofeng Yang, Yuzhen Ding, Xin Cheng, Shujie Xu, Meiyao He, Guang Wang und Xuesong Yang

Fünfte Medizinische Klinik (Nephrologie/Endokrinologie/Rheumatologie/Pneumologie), Universitätsklinikum Mannheim, Universität Heidelberg, Mannheim, Deutschland

Jingyun Wang

Abteilung für Histologie und Embryologie, Schlüssellabor für Regenerative Medizin des Bildungsministeriums, Jinan-Universität, No.601 Huangpu Road West, Guangzhou, 510632, China

Xin Cheng, Shujie Xu, Guang Wang und Xuesong Yang

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JW, PZ, ML und ZH haben Experimente entworfen und durchgeführt. XY, YD und JL sammelten Patientenproben und analysierten klinische Daten. SX, MH und FZ haben die Studie konzipiert. XC lieferte die Unterstützung für die statistischen Analysen. GW, RL und XY entwarfen das Werk und trugen die Hauptverantwortung für den endgültigen Inhalt. Alle Autoren analysierten und interpretierten die Daten. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Guang Wang, Ruiman Li oder Xuesong Yang.

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Overseas Hospital der Jinan-Universität, China (Genehmigungsnummer: KY-2021-054) genehmigt und in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Von allen Studienteilnehmern wurde eine unterzeichnete Einverständniserklärung eingeholt. Alle experimentellen Prozesse mit Tierbehandlungen wurden gemäß den Verfahren der Ethikkommission für Tierversuche der Universität Jinan (Genehmigungsnummer: 20210302-46) durchgeführt.

Das beschriebene Werk wurde bisher noch nicht veröffentlicht. Eine Veröffentlichung an anderer Stelle wird nicht in Betracht gezogen. Dieses Manuskript wurde von allen Co-Autoren genehmigt.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Antikörper für die Immunhistochemie. Tabelle S2. Antikörper für Western Blot. Tabelle S3. Details zu den Elisa-Bausätzen. Tabelle S4. Statistikdaten zu Tierversuchen. Ergänzendes Ergebnis 1. A2M-Sequenzierungsergebnis. Ergänzendes Ergebnis 2. Die klinischen und Labormerkmale und unerwünschten Schwangerschaftsausgänge schwangerer Frauen, die an dieser Studie teilnehmen. Abbildung S1. Bewertung der Plazenta- und Fötusentwicklung im A2M-Überexpressionsrattenmodell. Abbildung S2. Bestimmung der HTR-8/SVneo-Zellmigration und der Zelllebensfähigkeit nach A2M-Hochregulierung. Abbildung S3. Bestimmung der HTR-8/SVneo-Zellproliferation und Apoptose nach A2M-Hochregulierung. Abbildung S4. Korrelation zwischen PlGF-, sFLT-1- und A2M-Spiegeln im mütterlichen Plasma der Präeklampsie-Frauen. Abbildung S5. Bestimmung der Serum- und Plazentaspiegel menschlicher entzündlicher Zytokine und NF-κB. Abbildung S6. Bestimmung von Schlüsselkomponenten des RAAS-Systems im menschlichen Serum. Abbildung S7. Bestimmung von Schlüsselkomponenten des RAAS-Systems im Rattenserum in Gegenwart hoher A2M-Spiegel. Abbildung S8. Schematische Darstellung der Veränderungen in Schlüsselkomponenten des RAAS-Systems bei hohen A2M-Werten.

Western-Blot-Quellendaten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wang, J., Zhang, P., Liu, M. et al. Alpha-2-Makroglobulin ist an der Entstehung einer früh einsetzenden Präeklampsie beteiligt, da es sich negativ auf den Umbau der Uterusspiralarterien und die Angiogenese der Plazenta auswirkt. BMC Med 21, 90 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-02807-9

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Eingegangen: 12. August 2022

Angenommen: 22. Februar 2023

Veröffentlicht: 09. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-023-02807-9

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